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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 跪求大神指点关于ppic9k载体在酵母中表达
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肉肉肉.

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by evil丶zero at 2015-11-06 16:02:40
我也是做毕赤酵母Ppic 9K的表达。不知道你现在做的怎么样了？
表达手册上有MUTS的生长描述MM培养基上处于对数期MUT+的倍增时间为4-6小时
muts为18小时
另外，菌种不同时间也有差异。

你好！我还没表达出来！我快烦死了！就是按着人家论文里面的诱导方法进行诱导的！跑蛋白用银染显示可能有条带，然后用镍住纯化之后就没有蛋白了，用his标签的抗体做wb也没有！不知道问题出在哪里了，之前测序结果表明片段已经正确连上去了啊……毕业不能啊

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11楼2015-11-13 11:03:10
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肉肉肉.

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by uranuser at 2015-11-13 09:53:52
就应该是一个条带吧？因为你已经把目的片段转入了基因组，在组氨酸平板上长出的就是含有目的基因的菌。
另外，Muts型慢也不要紧，关键是表达量，如果Muts型表达量比Mut+型高，那就用Muts型

你好！请问你也是做9k表达的吗？我看了文献说mut+表型的是有两条条带的，所以我现在怀疑是不是我9k质粒上的aox1这个启动子被破坏了，所以很难诱导出蛋白来，好烦恼！

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12楼2015-11-13 11:05:08
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肉肉肉.

铁虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by evil丶zero at 2015-11-06 16:02:40
我也是做毕赤酵母Ppic 9K的表达。不知道你现在做的怎么样了？
表达手册上有MUTS的生长描述MM培养基上处于对数期MUT+的倍增时间为4-6小时
muts为18小时
另外，菌种不同时间也有差异。

谢谢

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13楼2015-11-13 11:05:44
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肉肉肉.

铁虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by uranuser at 2015-11-13 09:53:52
就应该是一个条带吧？因为你已经把目的片段转入了基因组，在组氨酸平板上长出的就是含有目的基因的菌。
另外，Muts型慢也不要紧，关键是表达量，如果Muts型表达量比Mut+型高，那就用Muts型

谢谢

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14楼2015-11-13 11:05:59
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uranuser

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 肉肉肉. at 2015-11-13 11:05:08
你好！请问你也是做9k表达的吗？我看了文献说mut+表型的是有两条条带的，所以我现在怀疑是不是我9k质粒上的aox1这个启动子被破坏了，所以很难诱导出蛋白来，好烦恼！
...

我现在也做9k。
得更正一下说法，我前面可能是弄错了，根据毕赤酵母手册还有文献，应该是有两条条带。既然你怀疑你的AOX1启动子被破坏了，那就重新换过在试吧。
另外，表达的话，根据其他虫友的说法，也许换换如温度或pH等条件会有所不同。
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15楼2015-11-18 20:17:54
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思密达佳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by evil丶zero at 2015-11-06 16:02:40
我也是做毕赤酵母Ppic 9K的表达。不知道你现在做的怎么样了？
表达手册上有MUTS的生长描述MM培养基上处于对数期MUT+的倍增时间为4-6小时
muts为18小时
另外，菌种不同时间也有差异。

请问你用的是什么试剂盒呢？

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16楼2015-11-26 09:19:48
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evil丶zero

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 思密达佳 at 2015-11-26 09:19:48
请问你用的是什么试剂盒呢？
...

你指的是什么用的试剂盒呢？最近课多都没怎么做实验.........唉我好颓废....
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17楼2015-11-26 16:00:00
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