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shadowing520

新虫 (初入文坛)

[求助] 求引物设计大神 已有1人参与

实验菜鸟，下面这段CDS序列需要扩全序列，但是引物总设计不好，用primer5设计分数不高，求各位大神帮忙设计下，万分感谢~~~~~~~~~~~~~
ATGCCTGTCACTTTTGATCAAGAACGCTATAATGTGTCTGTACCGTTTTCGACAGGTATTCACGGATTATCTGATGGCCATGGGATTCGAATTGTGGCAGTGCCAAAACATGGCGGGACGCTATTTACAGTGAATCTACGACGTGGTGACGATATTTATTTCCACTTCAATCCGCGCTTTAATCAAGGAGTAGTGGTGATGAACTGCGAAATTGGCGGCGCATGGCAACATGAAGAGTACATCGATCCCATTCCATTCACCGACTGCAAGCTGTTCACACTTGATCTCGTCTCCATTAATGGATCAGTCGAGATTGTCATTGATGGTGAACAACGAGGACGTTTCAGAATCCGTGAAGATCTGCGTCATGTGGATCGTTTTGAAGTGGACGGCGATGTAGAAGTTCATTCAGTTCATTATGGTGTTTGA
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1楼 2015-08-06 09:49:00
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shadowing520: 金币+5, ★有帮助 2015-08-06 16:08:25
你这个因为要扩全长，位置其实没什么余地，只能通过调整上下游引物的长度尽量使Tm值接近就好，如果要构建相应表达载体，自己根据该基因酶切位点信息、载体酶切位点信息选择在引物前加酶切位点。F:ATGCCTGTCACTTTTGATCAAGAAC
R:TCAAACACCATAATGAACTGAATGAAC
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2楼2015-08-06 11:54:39
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zjqfjj

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-08-06 11:54:39
你这个因为要扩全长，位置其实没什么余地，只能通过调整上下游引物的长度尽量使Tm值接近就好，如果要构建相应表达载体，自己根据该基因酶切位点信息、载体酶切位点信息选择在引物前加酶切位点。F:ATGCCTGTCACTTTTGA ...

F和R有什么区别
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3楼2015-08-06 12:14:17
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zjqfjj

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-08-06 11:54:39
你这个因为要扩全长，位置其实没什么余地，只能通过调整上下游引物的长度尽量使Tm值接近就好，如果要构建相应表达载体，自己根据该基因酶切位点信息、载体酶切位点信息选择在引物前加酶切位点。F:ATGCCTGTCACTTTTGA ...

能帮我设计一下这个引物吗，序列长度需要选择在100——300，万分感谢
ATGGCTGACAACAGAGATAAAACCACGGACCAGATGAAGATGTGGAAGGAGGGCCGTGGAGCTCAGAGGGCTGACAAGCTGACCACAGGGGCTGGCCATCCCATTGGAGACAAGCTGAACCTGCAGACTGCAGGTCCCAGGGGTCCTCTGCTGGTCCAAGATGTGGTCTTCACAGATGAGATGGCCCACTTCGACAGGGAACGAATTCCAGAGAGAGTGGTGCACGCCAAAGGGGCAGGGGCATTTGGCTACTTTGAGGTGACTCACGACATCAGTCGTTACTGCAAGGCCAAGGTGTTTGAGCACATCGGCAAGACTACGCCCATTGCTGTTCGCTTCTCCACTGTGGCCGGTGAATCGGGATCAGCTGACACTGTGCGAGACCCCCGAGGCTTTGCAGTCAAGTTTTACACTGAGGGTGGCAACTGGGACCTGACGGGCAACAACACCCCCATTTTCTTCATCAGGGACGCTCTACTGTTCCCGTCCTTCATCCACTCCCAGAAGCGTAATCCTCAAACCCACATGAAAGACCCTGACATGGTGTGGGACTTCTGGAGCCTGAGGCCAGAGAGTCTGCATCAGGTGTCCTTCTTGTTCAGCGATCGAGGTTTGCCCGACGGCTACCGTCACATGAACGGCTACGGCTCTCATACCTTCAAACTGGTCAACAGCAACGGCGAGCGCTTCTACTGCAAGTTCCACTACAAAACTGATCAAGGAATAAAGAATCTGCCGGTTGAGGAGGCAGACCGCCTGGCTTCCACCAACCCAGATTATGCCATCGGAGACTTGTTTAACGCCATTGCCAATGGGAACTTCCCGTCCTGGACTTTCTACATCCAGGTTATGACCTTTGAGCAGGCTGAGAAGTTCCAGTTCAACCCATTCGATCTTACCAAGGTTTGGTCACACAAAGAATACCCTTTGATCCCTGTGGGCAAAATGGTGCTGAACAGGAACCCAGTCAACTACTTTGCAGAGGTGGAGCAGCTGGCCTTTGACCCCAGCAACATGCCACCAGGCATCGAGCCAAGCCCTGACAAGATGCTGCAGGGTCGCCTCTTCTCCTACCCAGACACGCATCGACACCGTCTGGGAGCCAACTACCTGCAGCTCCCTGTCAACTGCCCCTTCAGGGCCCGCGTGGCCAACTACCAGCGCGATGGTCCTATGTGCATGTTTGACAACCAAGGTGGAGCTCCAAACTACTATCCAAACAGCTTCAGTGCCCCGGAGACCCAGCCTCAGTTTATGGAGTCCAAGTTCAGCGTGTCTCCAGATGTGGGACGTTACAACAGTGGAGATGAAGATAATGTCACGCAGGTTCGTACCTTCTACACTCAGGTGCTGAACAAAGAAGAACGCCAGAGACTTTGCCAGAACATGGCGGGAGCCCTGAAGGGAGCCCAGCTCTTCATCCAGAAACGCATGGTGGAGAACTTGAAGGCAGTCCATCCAGACTATGGAAACAGTGTTCAGACCCTTCTCGACAAGTACAATGCAGACGCCCAGAAGAACACAAACGTTCATGTTTACAGCCGTCCAGGAGCCTCAGCTGTTGCTGCGTCCTCAAAGATGTGA
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4楼2015-08-06 12:36:44
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zjqfjj at 2015-08-06 12:14:17
F和R有什么区别...

F（forward）：上游引物，R（reverse）：下游引物
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5楼2015-08-06 12:50:45
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shadowing520

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-08-06 11:54:39
你这个因为要扩全长，位置其实没什么余地，只能通过调整上下游引物的长度尽量使Tm值接近就好，如果要构建相应表达载体，自己根据该基因酶切位点信息、载体酶切位点信息选择在引物前加酶切位点。F:ATGCCTGTCACTTTTGA ...

还有个问题呢，我要做一个基因的耐药性检测，只有该基因的CDS序列，可是我是提取的DNA来做实验，请问可以用这个CDS全长序列设计引物来PCR吗？或者不用全长可以吗？扩增出来的效果应该是怎样的呢？？？求好心人解答
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6楼2015-08-06 16:14:45
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by shadowing520 at 2015-08-06 16:14:45
还有个问题呢，我要做一个基因的耐药性检测，只有该基因的CDS序列，可是我是提取的DNA来做实验，请问可以用这个CDS全长序列设计引物来PCR吗？或者不用全长可以吗？扩增出来的效果应该是怎样的呢？？？求好心人解答 ...

耐药性不了解，如果确定你的基因没有内含子，可以以DNA做模板扩增该段CDS全长。是否需要全长看你实验目的，一般做功能验证分析都需要用全长。
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7楼2015-08-06 17:28:31
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
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4楼: Originally posted by zjqfjj at 2015-08-06 12:36:44
能帮我设计一下这个引物吗，序列长度需要选择在100——300，万分感谢
ATGGCTGACAACAGAGATAAAACCACGGACCAGATGAAGATGTGGAAGGAGGGCCGTGGAGCTCAGAGGGCTGACAAGCTGACCACAGGGGCTGGCCATCCCATTGGAGACAAGCTGAACCTGCAGACTGCA ...

Forward primer        GACTTTGCCAGAACATGGCG        Plus        20        1373        1392        60.11        55.00        4.00        2.00
Reverse primer        ACATCTTTGAGGACGCAGCA        Minus        20        1582        1563        59.96        50.00        3.00        1.00
Product length        210
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。
8楼2015-08-06 18:09:02
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shadowing520

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by stone2239 at 2015-08-06 17:28:31
耐药性不了解，如果确定你的基因没有内含子，可以以DNA做模板扩增该段CDS全长。是否需要全长看你实验目的，一般做功能验证分析都需要用全长。...

不太明白什么叫基因没有内含子，难道不是所有基因都有内含子的么？
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9楼2015-08-06 20:34:29
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by shadowing520 at 2015-08-06 20:34:29
不太明白什么叫基因没有内含子，难道不是所有基因都有内含子的么？...

真核生物中有的基因有内含子，有的没有；原核生物基因没有内含子。
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10楼2015-08-06 22:36:37
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