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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求帮助设计引物啊？
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windleakey

金虫 (小有名气)

[求助] 求帮助设计引物啊？ 已有3人参与

各位做分子的大神，我想克隆一段基因，自己设计的引物一直P不出来，求大神帮助设计一对合适的啊，前后所加酶切位点分别是Bamh1、EcorR1。

序列（2235bp）是这样的：
ATGGCGAAGCAAAAAATTAAAATTAAAAAAAATAAAATAGGGGCAGTCCTACTTGTTGGTTTATTCGGACTGCTCTTTTTTATATTGGTTTTAAGAATTTCATATATCATGATTACTGGACATTCTAATGGTCAAGATTTAGTCATGAAGGCAAATGAAAAGTATTTAGTTAAGAATGCACAACAACCAGAACGAGGAAAGATATATGATCGTAATGGTAAAGTGCTAGCAGAAGATGTAGAAAGATATAAACTTGTTGCAGTAATAGATAAAAAGGCGAGTGCCAATTCTAAAAAACCTAGGCATGTAGTTGATAAAAAAGAGACTGCAAAGAAATTATCTACAGTCATTGATATGAAGCCAGAGGAAATTGAAAAGAGACTTAGTCAAAAGAAAGCCTTCCAAATTGAATTTGGACGCAAAGGAACAAATTTAACGTATCAGGACAAATTGAAAATAGAGAAAATGAATTTGCCTGGTATTTCTTTATTGCCTGAAACAGAACGCTTTTATCCAAATGGCAATTTTGCATCACACTTAATTGGTAGAGCTCAGAAAAATCCGGATACTGGTGAACTTAAAGGTGCGCTTGGGGTTGAAAAGATTTTTGATAGTTATTTAAGTGGATCTAAAGGATCATTGAGATATATTCATGATATTTGGGGATATATTGCACCAAATACTAAAAAAGAGAAGCAGCCTAAACGTGGTGATGATGTCCATTTAACAATCGATTCAAATATTCAAGTATTTGTTGAAGAAGCTTTAGATGGCATGGTTGAAAGATACCAGCCGAAAGATTTATTTGCGGTTGTCATGGATGCCAAAACTGGAGAAATTTTAGCATACAGTCAGCGACCAACATTTAATCCTGAAACTGGTAAAGACTTTGGTAAAAAGTGGGCAAATGACCTTTATCAAAACACATACGAGCCTGGATCAACATTTAAATCATATGGGTTAGCAGCTGCTATTCAAGAAGGTGCTTTTGATCCTGATAAGAAATATAAATCTGGACATAGAGATATTATGGGTTCACGTATTTCAGACTGGAATAGAGTCGGTTGGGGTGAAATCCCAATGTCACTCGGATTTACTTATTCATCTAATACATTGATGATGCATTTACAAGATTTAGTTGGTGCAGACAAAATGAAATCTTGGTATGAACGATTTGGATTTGGAAAATCAACTAAAGGTATGTTTGATGGAGAAGCACCTGGTCAAATTGGATGGAGTAATGAGTTGCAACAAAAAACGTCATCATTTGGTCAATCGACAACAGTAACACCTGTTCAAATGTTACAAGCGCAATCAGCGTTCTTTAATGATGGTAATATGTTAAAACCATGGTTTGTGAATAGCGTTGAAAATCCTGTTAGTAAAAGACAATTTTATAAAGGTCAAAAACAAATCGCAGGCAAACCAATAACAAAAGATACTGCTGAAAAAGTTGAAAAGCAATTGGATTTAGTTGTGAATAGTAAGAAGAGTCACGCTGCAAACTATCGTATTGATGGTTATGAGGTCGAAGGTAAGACTGGTACAGCACAAGTCGCTGCACCTAATGGTGGTGGATACGTTAAAGGTCCAAACCCATATTTTGTAAGTTTTATGGGTGACGCGCCGAAGAAAAATCCTAAAGTTATTGTATACGCTGGTATGAGCTTGGCACAAAAAAATGACCAAGAAGCTTATGAATTAGGTGTTAGTAAAGCGTTTAAACCAATAATGGAAAATACTTTGAAATATTTAAATGTAGGTAAATCAAAAGATGACACATCTAATGCAGAGTATAGTAAAGTGCCAGATGTTGAAGGTCAAGACAAACAAAAAGCTATTGATAATGTGAGTGCAAAATCATTAGAACCAGTTACTATCGGTTCTGGCACACAAATAAAAGCGCAATCTATAAAAGCAGGGAATAAAGTCTTACCTCATAGTAAAGTACTGTTATTAACAGATGGAGACTTAACTATGCCTGACATGTCAGGATGGACGAAAGAAGATGTCATTGCTTTTGAAAACCTAACAAATATTAAAGTAAATTTAAAAGGTAGCGGTTTTGTGTCCCACCAATCAATTAGTAAGGGACAAAAACTTACTGAAAAAGATAAAATAGACGTAGAATTTTCATCAGAGAATGTAGACAGCAATTCGACGAATAATTCTGATTCAAATTCAGATGATAAGAAGAAATCTGACAGTAAAACTGACAAGGATAAGTCGGACTAA
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1楼 2014-02-27 21:04:57
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forrestgump

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-28 11:45:42
这是短阅码框，别无选择啰，直接在5‘端家酶切位点就是了。只不过基因有点大，走cDNA因此有点难吧了。
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2楼2014-02-28 00:07:56
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by forrestgump at 2014-02-28 00:07:56
这是短阅码框，别无选择啰，直接在5‘端家酶切位点就是了。只不过基因有点大，走cDNA因此有点难吧了。

请问前后该截多长呢？特别是前面重复A这部分，不知道该怎么办。请问除了c DNA还有别的什么方法吗？
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3楼2014-02-28 08:44:56
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-28 11:45:47
我们一般都是直接取头尾各加上酶切位点共39个碱基，都能扩出来
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多情总被无情扰。。。愁
4楼2014-02-28 08:58:46
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jiaolong11a at 2014-02-28 08:58:46
我们一般都是直接取头尾各加上酶切位点共39个碱基，都能扩出来

谢谢回复，保护碱基+酶切位点+序列=39这样吗？
按照一般的引物设计原则，39感觉很大呢
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5楼2014-02-28 09:08:27
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forrestgump

新虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by windleakey at 2014-02-28 08:44:56
请问前后该截多长呢？特别是前面重复A这部分，不知道该怎么办。请问除了c DNA还有别的什么方法吗？...

往5‘RACE方向延伸序列，否则多A肯定不合适，快发金币！
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6楼2014-02-28 10:41:22
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-28 11:45:53
引用回帖:
5楼: Originally posted by windleakey at 2014-02-28 09:08:27
谢谢回复，保护碱基+酶切位点+序列=39这样吗？
按照一般的引物设计原则，39感觉很大呢...

对，我们只有在扩增基因时这样做。39个基因中光酶切位点就占10来个，如果靶位点序列太少的话，会结合不稳。你先试试吧。不过你这个A确实多，不知有影响吗
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多情总被无情扰。。。愁
7楼2014-02-28 11:23:18
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-02-28 21:39:25
你可以把基因往两端再扩大些合成引物，再一个你可以试试先不加酶切位点把序列先得到克隆到T载体再在载体上扩会简单些。
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hehe
8楼2014-02-28 20:47:37
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