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123q明

金虫 (小有名气)

[求助] 提取质粒和摇菌时候的问题。。。。。。。。。。 已有4人参与

目的基因与表达载体连接后,挑取单菌落pcr鉴定正确,然后提取质粒酶切鉴定,但是菌液过夜培养一直不够浑浊(3ml接入400ul菌液),提取的质粒也不亮,酶切鉴定过一次,单双酶切结果一样,都是一条带,大小一样,我又将同管菌液,质粒PCR鉴定,目的条带也正确,不知道到底是什么原因??????哪位知道,跪求指点!
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猛兽

木虫 (小有名气)

做PCR时用水做对照,看引物是否污染了母的基因
5楼2015-07-25 09:19:13
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查看全部 12 个回答

a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:59:32
123q明: 金币+2, 有帮助 2015-08-19 13:01:22
单双酶切后条带大小如何,片段大小是多少,如果比较少,你的质粒本身就少,是不是太少看不到切下的片段?纯属猜测哈~可以送个测序
2楼2015-07-24 09:34:24
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firthzhang

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:59:26
123q明: 金币+3 2015-08-19 13:01:12
你先试试将抗生素的浓度降低,还有你说的3ml菌加400,是在指管里?你换用大瓶50ml的摇菌,空间太小,菌体不宜生长,37度,180转,提质粒用的菌不要超过12h,在提质粒时最好将母种放置冰上
再出不来,我就去死!
3楼2015-07-24 11:20:56
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 20:00:28
就像3楼的建议,可以扩大培养试试,以前我也遇到过菌摇不起来,经常要16个小时才有浑浊,提取质粒浓度低,我的原因是因为我的慢病毒质粒太大了,将近1万bp,所以有人说质粒太大,菌就不好摇,后来扩大培养,做大提质粒,质粒浓度和纯度都还挺好的,不知道你的情况是不是和我一样
医学&统计学
4楼2015-07-24 15:35:22
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