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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒pcr
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Cllair

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒pcr

我提取到了质粒50ul，但是一做单酶切和双酶切实验鉴定的话就会用去很多，可能最后用来用载体连接的时候就没剩余多少了，而且我还想把质粒拿去测序一下。所以我想问一下，能不能直接对质粒进行pcr实验，如果可以的话，我就能大量获得质粒，不用来回的涂平板摇菌，再回收和再酶切鉴定了。请问诸位有尝试过这种实验的么，麻烦给点指导吧。不胜感激。。。
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有今生没来世，且行且珍惜。
1楼 2012-12-13 12:37:19
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shsDerek

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
转化Top10，再提质粒就可以获得大量质粒
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2楼2012-12-13 12:39:40
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看你质粒的大小，而且这样获得的质粒有发生点突变的危险，而胞内由于修复系统，几乎不会有突变。酶切后质粒丢失，可能是你回收的方法或试剂盒不好，建议考虑换个试剂盒。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2012-12-13 12:47:06
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也是刚刚知道可以直接用质粒pcr，而且这个只是一个大概的范围，老板建议直接测序

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单
4楼2012-12-13 13:19:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR总是会有错配的风险吧，如果不对了可能直接影响后面是克隆。如果不够再提一下也不麻烦。再说，经鉴定正确的质粒是从单克隆提出来的吧，直接把那个编号的克隆再摇一下提质粒就可以了，为什么还要来回铺板、摇菌、鉴定呀？
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5楼2012-12-13 14:53:51
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huoyongting

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提质粒很麻烦吗，直接搞一次大提，够你用N次了，PCR扩增质粒很难扩增到单一的质粒的，而且还会突变，提质粒是最简单的
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6楼2012-12-13 17:25:07
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶切的话，不用太多，一个反应2-3uL。
需要的多，可以回转大肠杆菌，再提质粒，要多少有多少。
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7楼2012-12-13 21:54:45
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shsDerek at 2012-12-13 12:39:40
转化Top10，再提质粒就可以获得大量质粒

我转化到DH5a里面去了、、、
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有今生没来世，且行且珍惜。
8楼2012-12-14 16:30:35
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-13 12:47:06
看你质粒的大小，而且这样获得的质粒有发生点突变的危险，而胞内由于修复系统，几乎不会有突变。酶切后质粒丢失，可能是你回收的方法或试剂盒不好，建议考虑换个试剂盒。
...

质粒pcr结果得到的还是质粒吗？怎么推断都感觉得到是目的片段呢。。。
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有今生没来世，且行且珍惜。
9楼2012-12-14 16:32:11
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 静安jingan at 2012-12-13 13:19:52
我也是刚刚知道可以直接用质粒pcr，而且这个只是一个大概的范围，老板建议直接测序

我现在把质粒送测序了，但愿能测出结果。
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有今生没来世，且行且珍惜。
10楼2012-12-14 16:34:45
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