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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提取质粒和摇菌时候的问题。。。。。。。。。。
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123q明

金虫 (小有名气)

[求助] 提取质粒和摇菌时候的问题。。。。。。。。。。 已有4人参与

目的基因与表达载体连接后，挑取单菌落pcr鉴定正确，然后提取质粒酶切鉴定，但是菌液过夜培养一直不够浑浊（3ml接入400ul菌液），提取的质粒也不亮，酶切鉴定过一次，单双酶切结果一样，都是一条带，大小一样，我又将同管菌液，质粒PCR鉴定，目的条带也正确，不知道到底是什么原因？？？？？？哪位知道，跪求指点！
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1楼 2015-07-23 23:42:18
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 20:00:28
就像3楼的建议，可以扩大培养试试，以前我也遇到过菌摇不起来，经常要16个小时才有浑浊，提取质粒浓度低，我的原因是因为我的慢病毒质粒太大了，将近1万bp，所以有人说质粒太大，菌就不好摇，后来扩大培养，做大提质粒，质粒浓度和纯度都还挺好的，不知道你的情况是不是和我一样
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医学&统计学
4楼2015-07-24 15:35:22
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firthzhang

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:59:26
123q明: 金币+3 2015-08-19 13:01:12
你先试试将抗生素的浓度降低，还有你说的3ml菌加400，是在指管里？你换用大瓶50ml的摇菌，空间太小，菌体不宜生长，37度，180转，提质粒用的菌不要超过12h，在提质粒时最好将母种放置冰上
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再出不来，我就去死！
3楼2015-07-24 11:20:56
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猛兽

木虫 (小有名气)
做PCR时用水做对照，看引物是否污染了母的基因
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5楼2015-07-25 09:19:13
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QQ小木

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, MolEPI+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 20:00:39
123q明: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-08-19 13:00:59
单双酶切只有一条带，应该有两种可能，一是酶切根本就没有切断，可能是酶切的效率不行，建议使用口碑较好的品牌；二是你目的片段的分子量较大，切下来的碎片段很小，所以看不到碎片段的条带，这要你自己分析一下是那种情况。
    这里我还建议，你试试比较一下酶切后的条带大小和PCR鉴定的条带大小是不是差不多大，如果差不多大说明应该是酶切掉了。
    你说的菌液不浓，我不知道你是用的多大的容器，多少体积的培养液摇的，反正有一点你要注意，液体在容器里摇的幅度必须不能太小，太小的话就等于根本没有要起来；另外要的时候一般是在37摄氏度，220 RPM的转速下摇，当然这个条件说的是大肠杆菌，其它菌可能有不同的条件吧。
    就说这么多，希望对你有帮助！
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10楼2015-07-25 09:56:43
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普通回帖

a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:59:32
123q明: 金币+2, ★有帮助 2015-08-19 13:01:22
单双酶切后条带大小如何，片段大小是多少，如果比较少，你的质粒本身就少，是不是太少看不到切下的片段？纯属猜测哈~可以送个测序
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2楼2015-07-24 09:34:24
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123q明

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 猛兽 at 2015-07-25 09:19:13
做PCR时用水做对照，看引物是否污染了母的基因

试过了，没有！
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6楼2015-07-25 09:21:00
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123q明

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 董博士 at 2015-07-24 15:35:22
就像3楼的建议，可以扩大培养试试，以前我也遇到过菌摇不起来，经常要16个小时才有浑浊，提取质粒浓度低，我的原因是因为我的慢病毒质粒太大了，将近1万bp，所以有人说质粒太大，菌就不好摇，后来扩大培养，做大提质 ...

恩！我试试，你们接菌比例是多少呢
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7楼2015-07-25 09:23:17
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123q明

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by firthzhang at 2015-07-24 11:20:56
你先试试将抗生素的浓度降低，还有你说的3ml菌加400，是在指管里？你换用大瓶50ml的摇菌，空间太小，菌体不宜生长，37度，180转，提质粒用的菌不要超过12h，在提质粒时最好将母种放置冰上

12h菌量太少，我们这边提取质粒一般14h
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8楼2015-07-25 09:25:51
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Ailly950

新虫 (小有名气)
来看回复的…感谢大神们分享经验…

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9楼2015-07-25 09:45:23
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