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一桶稀泥

木虫 (正式写手)

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[求助] PBI121载体单酶切比双酶切的条带偏下？已有1人参与

各位大侠，连接表达载体的困惑我很长时间了，之前一直将目的条带连接表达载体PBI121，每次都不长斑，即使长了，挑20个菌落PCR都有目的条带，但是质粒都提不出来，不知长出来的是什么？
最近重新做，发现我单纯的PBI121单酶切和双酶切位置竟然不对，图1为我提取PBI121质粒的图片（质粒一直-20℃保存，我取20mlLB,加20ul菌液，加入20ul，50mg/ml的Kna,摇菌10h,已经能看出菌浑浊的很好）；电泳条件：琼脂糖凝胶为1%，条件U=120，I=120，T=20min。泳带1：2K Marker;2-11为PBI121质粒。
图2为PBI121和目的条带的单酶切和双酶切图片，电泳条件：琼脂糖凝胶为3%，U=80，I=80，T=40min。
如图2：泳带1：2K Marker;2

BI121 SmalI单酶切；3：PBI121 XbalI单酶切；4-13都是PBI121 的SmalI和XbalI双酶切;14：PBI121 XbalI单酶切；15：PBI121 SmalI单酶切；16:2Kmarker,17:15k Maker;18-20都是我目的基因的SmalI和XbalI的双酶切，目的基因大小为513bp。21:2Kmarker.昨天做的时候忘记点质粒了，所以可能缺少个对照，一会就去做，另外我目的基因没有做单酶切。15K marker跑剩4条带了。
根据图1：第9泳带和10泳带PBI121位置偏上，不知道什么原因，仔细看图，好像每个条带下面还有个弱弱的条带；请各位指点。
根据图2：单酶切的位置要比双酶切的位置偏上，但是都很干净，只有一条带，貌似切的很完全。而我的目的基因位置很正常，但是能看到胶口像是有条带，以前也遇到过这种问题，我再跑多长时间，这个带都不会下来，之前遇到的问题是我连接目的基因后挑20个菌落，PCR，20个菌落，有19个都是和泳带17-19的样子一样，只有一个没有，胶口很正常，跑了两次胶都是这样。提质粒，什么都没有，也让我很困惑。
谢谢大家了！！！！万分感谢！！！！！！