应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » 双抗夹心ELISA 重组抗原严重吸附到板上，怎么解？
71/1返回列表
查看: 1216  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

ayiyaya

金虫 (小有名气)

[求助] 双抗夹心ELISA 重组抗原严重吸附到板上，怎么解？ 已有1人参与

直接封闭板条+抗原孵育+酶标抗体孵育=显色较高
直接封闭板条+酶标抗体孵育=几乎不显色
个人以为这是因为抗原吸附到板子上了，尝试过用1%BSA和5%脱脂奶封闭，效果都差不多，加抗原孵育的OD依然居高不下。
求高人指教！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-07-21 10:43:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lietomepls

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你能不能把实验操作说得再详细一点
赞一下 回复此楼
2楼2015-07-22 11:36:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ayiyaya

金虫 (小有名气)
本来是做棋盘滴定，纵向倍比稀释包被抗体，横向倍比稀释酶标抗体，抗原浓度相同。结果发现OD只跟酶标抗体稀释度有关，而不同包被浓度之间OD没有差别。当时怀疑可能是抗原吸附到板子上了，所以就做了一个验证试验，不包被抗体，直接封闭板条，加抗原孵育，然后再加酶标抗体孵育，显色，阴性对照也是用直接封闭的板条，直接加酶标抗体孵育，显色。结果加了抗原板条有显色，不加抗原的板条不显色，证明了是抗原非特异性吸附到板条上面。找到了原因，可是不知道怎么解决···
赞一下 回复此楼
3楼2015-07-22 13:02:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ayiyaya

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lietomepls at 2015-07-22 11:36:30
你能不能把实验操作说得再详细一点

本来是做棋盘滴定，纵向倍比稀释包被抗体，横向倍比稀释酶标抗体，抗原浓度相同。结果发现OD只跟酶标抗体稀释度有关，而不同包被浓度之间OD没有差别。当时怀疑可能是抗原吸附到板子上了，所以就做了一个验证试验，不包被抗体，直接封闭板条，加抗原孵育，然后再加酶标抗体孵育，显色，阴性对照也是用直接封闭的板条，直接加酶标抗体孵育，显色。结果加了抗原板条有显色，不加抗原的板条不显色，证明了是抗原非特异性吸附到板条上面。找到了原因，可是不知道怎么解决···
赞一下 回复此楼
4楼2015-07-22 13:04:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lietomepls

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
ayiyaya: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2015-07-23 14:27:18
包被抗体-A
抗原-B
酶标抗体-C
棋盘滴定：
1.固定C，横向倍比稀释A，纵向倍比稀释B--确定A的最佳包被浓度(先预估一个酶标抗体的稀释倍数，如果是商品化的酶，根据说明书的数据，选个中间值即可，过量也无所谓)
2.固定A，横向稀释B，纵向稀释C--确定C的最佳工作浓度，毕竟是酶标抗体，很贵的。

你的CBT做法有问题。
这里有本书，你可以回去好好研究研究
http://pan.baidu.com/s/1bnfj1HP

你的验证实验，并没有提到抗原的使用浓度，如果浓度过高，是有非特异性吸附的可能性，即使是已经封闭好的板子也一样，所以，我建议你还是先做CBT，确定两个抗体的使用浓度。ELISA这种实验，不是万能的，被检物的浓度过高过低都会影响ELISA结果的可靠性。
赞一下 回复此楼
5楼2015-07-23 11:51:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ayiyaya

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lietomepls at 2015-07-23 11:51:06
包被抗体-A
抗原-B
酶标抗体-C
棋盘滴定：
1.固定C，横向倍比稀释A，纵向倍比稀释B--确定A的最佳包被浓度(先预估一个酶标抗体的稀释倍数，如果是商品化的酶，根据说明书的数据，选个中间值即可，过量也无所谓)
...

谢谢！
回复此楼
6楼2015-07-23 14:28:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ayiyaya

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lietomepls at 2015-07-23 11:51:06
包被抗体-A
抗原-B
酶标抗体-C
棋盘滴定：
1.固定C，横向倍比稀释A，纵向倍比稀释B--确定A的最佳包被浓度(先预估一个酶标抗体的稀释倍数，如果是商品化的酶，根据说明书的数据，选个中间值即可，过量也无所谓)
...

抗原浓度全部用的0.5ug/ml，CBT也是别人教的···。我看网上的棋盘滴定基本上也是这个套路，不过一般是说做两个抗原浓度，一个强阳，一个弱阳，因为我也不太清楚什么浓度算强阳，什么浓度算弱阳，所以就选了一个过量的Ag浓度。这两天换了封闭液，抗原吸附的问题是解决了，不过棋盘滴定还需要研究一下···
另外，酶标抗体是自己做的，没有说明书，只能自己摸条件···
赞一下 回复此楼
7楼2015-07-23 14:35:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 ayiyaya 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭