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[交流]
关于western blot转膜，请教大神
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| 小女子最近开始做western blot实验以求毕业，跑page显示的是有蛋白，但是转膜曝光之后一直没有条带，转膜后看得到marker，马上用丽春红染，也看不到蛋白，用考马斯亮蓝染剩下的胶，发现上面还剩下的是小分子蛋白。求助一下大神这是什么情况：为什么小分子的蛋白还留在胶上面？膜上一直检测不到蛋白？跪谢，不胜感激！！！！ |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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凌波丽
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WB出现非特异性条带的原因与解决方法 凌波丽 2015年7月16日 1.抗体浓度过高；降低一抗、二抗的浓度，可以分梯度进行。 2.一抗的特异性不足；使用单克隆抗体，单克隆位点的抗原表位是唯一的，多克隆位点的表位不唯一。 3.二抗的非特异性结合，不加一抗，其他操作不变，即可检测出二抗的非特异性的条带是否来自二抗的非特异性结合；此时需要重新选择二抗。 4.样品蛋白质上样量过大；降低上样量，可以分梯度进行。 5.样品蛋白质发生了降解，降解产物成为了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是单克隆抗体时更为明显；避免对样品蛋白质反复冻融，食用新鲜的蛋白质样品，可以使用蛋白酶的广谱抑制剂（已经有商用产品），必要的话使用分子筛层析或HPLC纯化蛋白质样品后再上样（HPLC不能用于蛋白质制备，不过用做WB的量还是能够提供的）。 6.细胞传代过多，导致蛋白质变异。使用传代次数少的细胞的表达的蛋白质进行对比，并且作为分子筛层析或HPLC的纯化标准，分子筛层析或HPLC能够分离出构象差异的同分异构体。可以在上样前，用红外、紫外光谱检测一下，并且对比标准品的数据。 7.因为WB的一抗识别的蛋白质的表位是顺序表位，不是空间表位，所以WB状态下的抗原-抗体识别，与非变性的生理条件下的抗原-抗体识别不同。 8.WB之前，先用分子筛纯化同时也是检测一下目的蛋白产物是否成功。也就是目的蛋白是否成功表达了，而且在提取后稳定存在了。 9.非特异性的条带分子量出现可能是SDS PAGE出的问题，胶的浓度不合适或者样品溶解度不够或者电泳时间不合适等，造成了目的条带的表观质量变化。但是如果最终带与目的蛋白质的分子量差距非常大，那么就不是SDSPAGE电泳引起的蛋白质的表观分子量变化的问题了。 10.多个非特异性的分子量不同的带出现可能是目的蛋白在SDS PAGE电泳出的问题出了问题，也可能本来就是杂带了。可以回收后对各条带用质谱检测精确的分子量加以确定。 11.多个非特异性的分子量不同的条带至少应该有杂带，杂带出现而且与一抗相互作用，那么只能说杂带的顺序表位也能被一抗识别，必须更换专一性更高的抗体。 12.使是线性表位在“变性蛋白质抗原”的折叠态中也可能会产生空间位阻的问题： （1）因为“变性蛋白质抗原”中的线性表位的空间位阻可能不同于“复性蛋白质抗原”的线性表位的空间位阻，这样“变性蛋白质抗原”的线性表位产生的抗体，使得“复性蛋白质抗原”-“变性蛋白质的抗体”彼此根本接近不了，而使“变性蛋白质的抗体”无法识别“复性蛋白质”的线性表位； （2）可能“变性蛋白质的抗体”能够识别“复性蛋白质”的线性表位，但是由于“变性蛋白质”的抗体与“复性蛋白质”的相互作用时由于位阻而导致“变性蛋白质”的抗体与“复性蛋白质”的接触面无法发生有效的空间形状的变形契合以及使两者的接触面无法发生电荷有效的互补，从而使得抗原-抗体反应不能有效发生，没有具体检测不可以排除这种可能性； 另外一个问题：变性蛋白质的抗原的不同于复性蛋白质抗原的折叠态，未必不会使变性蛋白质的抗原有新的线性表位或空间表位形成，变性蛋白质的抗原产生的抗体可就复杂了。 上面说的比较拗口，不知道各位能否看明白，总之，加入了蛋白质折叠问题，抗原的线性表位很可能不仅仅与其氨基酸序列相关。 13.非特异性的蛋白质的序列表位与一抗还能够相互作用。 11、12与13都需要更换专一性更好的单克隆抗体。 我刚刚写完的，楼主参考一下吧。 |
8楼2015-07-16 13:42:41
18761615793
木虫 (正式写手)
小虫
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10楼2015-07-17 11:09:22
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2楼2015-07-16 08:57:17
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3楼2015-07-16 08:59:31
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