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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 放线菌提取DNA做PCR一直做不好
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薇_薇^_^

铁虫 (初入文坛)

[求助] 放线菌提取DNA做PCR一直做不好 已有4人参与

从提取DNA开始就困难重重，我把我的方法写下来，请各位大神指正
  第一次：用液氮研磨放线菌，剩余量很少，安上海生工的真菌试剂盒（他们没有放线菌试剂盒，推荐的真菌试剂盒）的步骤来做，电泳检测直接没有，有一个也是可能DNA降解了。
第二次：直接加溶菌酶，200微升Buffer体积加100微升100mg/ml的溶菌酶，37℃水浴3/4个小时，后面加蛋白酶K56摄氏度水浴2h
第三次：微波处理1min，后面步骤都一样，结果都扩散了
我查文献人家都用50v或80v电压，大概1.5h跑完，但我有查到电泳时间太长也会时DNA降解，为了让时间缩短，用了180v,150mA,25min跑完。是不是这个原因使DNA降解了？若我改成80v电压，电流改成多大好呢？还有说有很多放线菌可能会有DNA硫修饰，这样在跑胶点时候，就会发生弥散状，到底是怎么回事呢？
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1楼 2015-07-04 10:54:51
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
溶菌酶过夜处理，提的好好的

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-07-04 14:58:20
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shmilying

铁杆木虫 (著名写手)
呼我，告诉你个秘方。。。
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何处是我的岸
3楼2015-07-04 18:00:30
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wzh109

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们实验室使用OMEGA的细菌基因组提取试剂盒提取放线菌的基因组，效果很好，你可以试一下。
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4楼2015-07-05 11:09:58
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一支糖

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我前几天才手提了放线菌的基因组，总体方法和提细菌的差不多，但是我是加了溶菌酶37度水浴1小时后，又加蛋白酶K和sds37度水浴1小时，然后在加异丙醇沉淀之前加了1/6体积的醋酸钠，就提出来了，我跑的胶是120V，20min。
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5楼2015-07-05 16:59:30
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LXTlxt001

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shmilying at 2015-07-04 18:00:30
呼我，告诉你个秘方。。。

我也是PCR的时候用的27F和1492R的通用引物但是有的能P出来，有的P不出来

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6楼2016-01-19 23:09:22
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auntwang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wzh109 at 2015-07-05 11:09:58
我们实验室使用OMEGA的细菌基因组提取试剂盒提取放线菌的基因组，效果很好，你可以试一下。

您好，我现在也用OMEGA的细菌基因组提取试剂盒提取放线菌的基因组，但是一直提取不出来，请问您当时做的时候有没有改变的步骤呢，还是完完全全按照试剂盒的说明书做的呀。
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7楼2018-04-15 19:18:36
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J1663141418

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

提取的关键是破壁处理，按OMEGA细菌DNA提取试剂盒操作程序时，一定要加玻璃粉，最大速度涡旋震荡5分钟。该试剂盒的可选步骤我都有做，最后就是空置离心干燥柱，最好用最大离心速度（至少12000）干燥。其他步骤的话按试剂盒说明小心操作就好。我带新手提放线菌瘤DNA时，简要说了下操作流程，着重提示了上述两点，都有条带，亮度还不错。
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8楼2018-11-09 10:46:42
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北野清风

新虫 (初入文坛)
你好！我最近也是用这个试剂盒做放线菌DNA提取，DNA提的成功的，就是p不出目的条带，不知道怎么回事。。

发自小木虫Android客户端
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9楼2020-12-07 19:21:57
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山舞银蛇

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以买提结核杆菌的试剂盒来做，或者参考文献
结核杆菌就是一种典型的放线菌
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核酸提取与Taqman诊断
10楼2020-12-08 09:39:33
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