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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体自连问题
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青苹果QT

金虫 (小有名气)

[求助] 载体自连问题 已有3人参与

如何避免载体自连？
双酶切，然后连接，但是有时候会自连
求好方法
谢谢
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1楼 2015-05-23 13:44:43
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
怀疑人生，不如怀疑假货！
双酶切自连率非常低，你检测下载体是否切干净咯。
如果无论怎么做都切不干净，坚决跟老师报告酶不行了，一定要坚决哦
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2楼2015-05-23 16:06:25
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erland21411

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般如果你双酶切之后跑胶只有一条带就可以认为质粒被切开了~
有的酶的酶切位点比较相似时就是容易载体自连，尤其是在使用T4这种连接效率低识别率低的连接酶的时候，我们实验室用Hind III和EcoR I双酶切的时候就特别容易发生载体自连。
可以考虑换酶切位点，或者换连接酶。
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3楼2015-05-23 22:24:11
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体自连一般都会发生，只是效率高低而已。如果两个酶切位点离得很近，就更容易发生切不干净的问题。我感觉最好的方法是从已经构建好的载体上切下来，然后再胶回收。这个对于我来说最好用。
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4楼2015-05-24 06:13:20
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虫儿飞不飞

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by erland21411 at 2015-05-23 22:24:11
一般如果你双酶切之后跑胶只有一条带就可以认为质粒被切开了~
有的酶的酶切位点比较相似时就是容易载体自连，尤其是在使用T4这种连接效率低识别率低的连接酶的时候，我们实验室用Hind III和EcoR I双酶切的时候就特 ...

最近也遇到了使用HindIII和EcorI酶切的位点就特别多的自连，而用NdeI和KpnI切的位点连接就很正常，看到你的说法也证实了我的假设，正在换酶切位点；
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朝闻道，吃酸粥
5楼2020-11-21 15:39:02
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