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杜仲谷

木虫 (职业作家)

金虫

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[求助] 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

已经一个星期了，每次都是溴酚蓝的位置出现条带被“压缩”的现象，溴酚蓝条带成了非常直的一条线，而二甲苯青却没事。
我做的是EST-SSR的，PCR之后，6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
（1）新配置的loading buffer配方如下：
含有去离子甲酰胺4.9ml，
溴酚蓝0.0625g，
二甲苯青FF0.0625g，
0.5M的EDTA（pH8.0）1ml;
最终：
98%的去离子甲酰胺，
10mmol/L的EDTA
0.125%的溴酚蓝，
0.125%的二甲苯青FF。
（2）电泳时候的缓冲液使用的是：
5×TBE稀释成1×TBE，
每次都是上槽中使用新稀释的1×TBE，下槽中不换，
且5×TBE没有调整过pH,请问，这有影响吗？？？
5×TBE配方参考《分子克隆实验指南》（第三版）配置，使用的是未灭菌的蒸馏水，请问需要使用灭过菌的去离子水吗？
因为缓冲液很快就会用掉，所以没有灭菌，且，缓冲液中本身就含有离子，所以，没有使用去离子水，请问，这是导致我照片中现象的原因吗？
（3）玻璃板也新买了两组，仍然存在这个问题，这说明不是玻璃板的问题
（4）电压150V，我的电泳槽是20cm长，电场强度是7.5V/cm.每次都是这个电场强度，但是电流不是固定的，90mA,或者80mA都有可能，因为在电泳中，玻璃板会发烫，电阻会有改变，电流无法一直保持恒定，所以电流是变化的，请问这是可能的因素吗？请问大家是怎么设置电泳电压和电流的？
（5）凝胶配方：
①40%的母液配方：聚丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺（37.5:1）干粉40g，加入灭菌的去离子水，配置成100ml母液，4℃保存。请问是因为37.5:1而导致的这种结果吗？文献中多用的29：1，我怀疑是这个原因。
②6%变性聚丙烯酰胺配方：
生工的尿素169.4g,
40%聚丙烯酰胺凝胶母液60mL,
5×TBE缓冲液80ml,
灭菌的去离子水定容至400ml,
充分溶解尿素，混匀，4℃保存。
最终，尿素是7mol/L。
怀疑，尿素是生工的产品，是不是尿素纯度不够？我订购的是分子生物级别的，感觉也不像是这个问题，请问大家用谁家的尿素？Sigma的吗？
（6）凝胶时间：
50ml的6%变性聚丙烯酰胺凝胶液体，
50μL的TEMED，
1ml的20%过硫酸铵（APS）新配置的溶液（每次都是使用2mL的ep管做容器，加入过硫酸铵固体，固体的量铺满ep管底部即可，并不进行准确称量，大约0.2g，灭过菌的去离子水1ml，新配置，混匀。注：过硫酸铵因为有毒性，在通风橱中操作，且不准确称量，因为根据多次实践经验，铺满2ml的ep管底部即约为0.2g）
灌注凝胶之前，注射器反复抽吸、吹打3次，以确保各成分混匀。
用注射器吸取足量的凝胶，一次性灌注成功，坚决避免了两次灌注。插上梳子，过夜凝固。
且，电泳结束以后，拆开玻璃板，仔细检查凝胶，看不到凝胶有分层的现象。

请问大家又没有谁清楚这个原因？
我愿意补偿金币给您的回复。谢谢了！比较着急
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电泳结束（第1块胶）.JPG