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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] 求碱性蛋白native-page配方及电泳方法 已有1人参与

我的蛋白的等电点在8点多，现在要做蛋白的native-page，已经按碱性蛋白的native-page的配方　　　分离碱性蛋白
　　　要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：
　　　1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；
　　　2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；
　　　3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5
　　　将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂
跑过一次电泳，但是没有条带，哪位大侠知道碱性蛋白的native-page胶的配方及电泳注意事项啊？！多谢啦呀

[ Last edited by 1949stone on 2013-5-27 at 10:44 ]
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1楼 2013-05-26 08:57:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

笔墨之书生

铁虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 18:42:46
非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS 等。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。

分离酸性蛋白

工作液配制

1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；

2. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃ 贮存；

3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃ 贮存；

4. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1l ，4℃ 贮存；

5. 2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20℃贮存；

6. 10%APS；

7. 0.25%考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；

8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O

电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）

1. 碱性非变性胶      17%分离胶(10 ml)       4%堆积胶(5 ml)

2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）   4.25ml       0.5ml

3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)       2.5ml

4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)       1.25ml

5. 水     3.2ml

6. 10%APS 35 μl

7. TEMED    15 μl

8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到1L

电泳条件 :100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。

染色和脱色:取出胶板于0.25%考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。也可以用银染或者活性染色。

分离碱性蛋白

要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：

1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；

2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；

3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5

将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂

实验操作同分离酸性蛋白。

回收

native-PAGE结束以后，采用电泳的方法进行回收，方法如下：

电泳结束以后，切取部分染色，然后根据染色结果切取含有蛋白质的胶带装入处理过的透析袋中，加入适量的缓冲液，最后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中，并在电泳槽中加入适量的缓冲液（和透析袋中的缓冲液相同），低温电泳2-3小时即可。回收蛋白所用的缓冲液一般和电泳所用的缓冲液相同。
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5楼2013-05-29 11:53:04
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志子

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-26 16:50:33
试试把APS和TEMED的用量加倍，再看看凝结情况
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2楼2013-05-26 14:35:15
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 志子 at 2013-05-26 14:35:15
试试把APS和TEMED的用量加倍，再看看凝结情况

5ml的胶量APS加了75ul， TEMED加了25ul，这个量还不够大吗？胶的凝结也没什么问题！跟胶的凝结情况有关系吗？！
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3楼2013-05-26 15:46:46
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
自己顶一下，做过的大侠帮帮忙呗
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4楼2013-05-27 09:01:14
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 笔墨之书生 at 2013-05-29 11:53:04
非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS 等。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候 ...

您发的这些我都已经看过很多遍了，现在的问题是我的胶上没有条带
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6楼2013-05-29 14:33:51
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-16 16:04:29
非变性凝胶电泳中，样品蛋白质的PH是重要的影响因素，要根据样品蛋白质的pI值来选定合适的电泳缓冲溶液，电泳缓冲溶液的pH只应该高于样品蛋白质的pI值。

你把电泳缓冲溶液换成1.5 M Tris-HCl，pH 8.8试试看吧。
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7楼2013-06-16 15:25:17
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-16 15:25:17
非变性凝胶电泳中，样品蛋白质的PH是重要的影响因素，要根据样品蛋白质的pI值来选定合适的电泳缓冲溶液，电泳缓冲溶液的pH只应该高于样品蛋白质的pI值。

你把电泳缓冲溶液换成1.5 M Tris-HCl，pH 8.8试试看吧。

用过1.5M Tris-HCl ph8.8，一样没有条带
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8楼2013-06-17 09:18:26
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

那木我的意见是改用SDS-PAGE，如果一定要用电泳的话。
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9楼2013-06-17 10:06:52
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-06-19 11:00:23
非变性凝胶电泳中，样品蛋白质的PH是重要的影响因素，要根据样品蛋白质的pI值来选定合适的电泳缓冲溶液，电泳缓冲溶液的pH只应该高于样品蛋白质的pI值。目的蛋白质的等电点已经是在8+，缓冲溶液PH值到8.8 也就到极限了，两者的直拉不开，用非变性凝胶电泳分离该种碱性蛋白质意义已经不大了，直接用分子筛层析或离子交换树脂应该容易分离，至于检测分立后的样品的纯度，直接用质谱很方便。
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10楼2013-06-17 10:59:06
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