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sassfras

捐助贵宾 (初入文坛)

[求助] 为什么DNA跑PAGE时严重缺带 已有1人参与

我做SSR分子标记,所加物质浓度,DNA:1.5,Taq:0.3,Mgcl2:1,PCR buffer:1.5,dNTP:1,水:7.7,引物:2;反应体系:94度:3m,94度:30s,退火:30s,72度延伸:30s,72度延伸:7m,循环:35;8%非变性胶,120的电压。但是我跑50个样有些引物会有20多个样品缺带,而有些样品只有6个左右缺带,请求各位高手指点。
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yingheqian

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你用Agrose检测都有条带吗?这种情况比较复杂,有可能部分引物就是在那些品种中就扩增不出来,说明在该位点有突变。或者带的大小差异过大。
一般来说,PCR体系可以略大一点,用Agrose先检测一下,看看结果,再上PAGE。
这个工作量很大,分析也不是很容易,如果经费许可,荧光标记引物,用测序仪做吧
2楼2015-04-27 15:40:58
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sassfras

捐助贵宾 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yingheqian at 2015-04-27 15:40:58
你用Agrose检测都有条带吗?这种情况比较复杂,有可能部分引物就是在那些品种中就扩增不出来,说明在该位点有突变。或者带的大小差异过大。
一般来说,PCR体系可以略大一点,用Agrose先检测一下,看看结果,再上PA ...

我有用琼脂糖检测,能检测出来,但是我做了很长一段时间,老是有些却缺带少,有些缺带多
3楼2015-04-27 15:47:17
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yingheqian

金虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by sassfras at 2015-04-27 15:47:17
我有用琼脂糖检测,能检测出来,但是我做了很长一段时间,老是有些却缺带少,有些缺带多...

Agrose检测的时候带的大小和亮度都一致吗?如果是,那是你跑PAGE的时候的问题了,需要提高实验技巧
4楼2015-04-27 15:52:04
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sassfras

捐助贵宾 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by yingheqian at 2015-04-27 15:52:04
Agrose检测的时候带的大小和亮度都一致吗?如果是,那是你跑PAGE的时候的问题了,需要提高实验技巧...

亮度和大小是有区别的,您指的实验技巧是指哪些方面,我把我操作上有可能出现的一些问题跟您说一下,看一下哪些方面是不对的,我PCR加样时,先把DNA模板加到PCR管中,然后把其它溶液按比例混匀,然后,再加到每个PCR管中(每次都会出现有的管液体多一些,有些管液体少一些),然后离心混匀,放入PCR仪。制胶之前会出现很小的气泡,后来没有了,缓冲液也给换了。
5楼2015-04-27 16:08:22
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请叫我HZ

新虫 (初入文坛)

请问你120的电压要跑多久呢?还有marker和琼脂糖的用的一样吗?

发自小木虫Android客户端
6楼2015-12-13 01:41:40
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