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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 为什么DNA跑PAGE时严重缺带
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sassfras

捐助贵宾 (初入文坛)

[求助] 为什么DNA跑PAGE时严重缺带 已有1人参与

我做SSR分子标记，所加物质浓度，DNA：1.5，Taq：0.3，Mgcl2：1，PCR buffer:1.5,dNTP:1,水：7.7，引物：2；反应体系：94度：3m，94度：30s，退火：30s,72度延伸：30s，72度延伸：7m,循环：35；8%非变性胶，120的电压。但是我跑50个样有些引物会有20多个样品缺带，而有些样品只有6个左右缺带，请求各位高手指点。
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1楼 2015-04-27 15:35:32
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yingheqian

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sassfras at 2015-04-27 15:47:17
我有用琼脂糖检测，能检测出来，但是我做了很长一段时间，老是有些却缺带少，有些缺带多...

Agrose检测的时候带的大小和亮度都一致吗？如果是，那是你跑PAGE的时候的问题了，需要提高实验技巧
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4楼2015-04-27 15:52:04
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yingheqian

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用Agrose检测都有条带吗？这种情况比较复杂，有可能部分引物就是在那些品种中就扩增不出来，说明在该位点有突变。或者带的大小差异过大。
一般来说，PCR体系可以略大一点，用Agrose先检测一下，看看结果，再上PAGE。
这个工作量很大，分析也不是很容易，如果经费许可，荧光标记引物，用测序仪做吧
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2楼2015-04-27 15:40:58
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sassfras

捐助贵宾 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yingheqian at 2015-04-27 15:40:58
你用Agrose检测都有条带吗？这种情况比较复杂，有可能部分引物就是在那些品种中就扩增不出来，说明在该位点有突变。或者带的大小差异过大。
一般来说，PCR体系可以略大一点，用Agrose先检测一下，看看结果，再上PA ...

我有用琼脂糖检测，能检测出来，但是我做了很长一段时间，老是有些却缺带少，有些缺带多
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3楼2015-04-27 15:47:17
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sassfras

捐助贵宾 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yingheqian at 2015-04-27 15:52:04
Agrose检测的时候带的大小和亮度都一致吗？如果是，那是你跑PAGE的时候的问题了，需要提高实验技巧...

亮度和大小是有区别的，您指的实验技巧是指哪些方面，我把我操作上有可能出现的一些问题跟您说一下，看一下哪些方面是不对的，我PCR加样时，先把DNA模板加到PCR管中，然后把其它溶液按比例混匀，然后，再加到每个PCR管中（每次都会出现有的管液体多一些，有些管液体少一些），然后离心混匀，放入PCR仪。制胶之前会出现很小的气泡，后来没有了，缓冲液也给换了。
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5楼2015-04-27 16:08:22
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