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rescuz

金虫 (小有名气)

[求助] 关于原核生物RNA提取,最后总是有基因组残余问题,求帮助 已有1人参与

如题所示,Lz最近在进行分子实验,需要提取目的菌株的RNA作为阴性对照,用反转录得到的CDNA进行PCR,所以对RNA的纯洁度有很高要求,但是每每提取RNA接着直接以RNA为模版,用基因组的任意引物PCR都能得到较亮的目的条带,,所以肯定是有基因组污染的,LZ很困惑啊,希望大家多多赐教!!!
ps用水做了阴性对照,木有p出条带,在超净台里准备的实验。
pcr程序 primer star MAX 98度10s;55度10s;72度30s,35-40个循环,目的片段大小有500bp长短的也有1000bp左右的,所以时间设为30s.
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rescuz

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by clark2010 at 2015-04-15 00:26:44
在反转录之前用DNA酶再处理一遍。然后高温(好像42度,这个不是很确定,看说明书吧)让DNA酶失活,然后再反转录

我尝试处理过,可是最后发现还是有基因组残余啊(用引物pcr),而且最后RNA量似乎很低了。
3楼2015-04-15 14:34:43
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clark2010

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
在反转录之前用DNA酶再处理一遍。然后高温(好像42度,这个不是很确定,看说明书吧)让DNA酶失活,然后再反转录
2楼2015-04-15 00:26:44
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clark2010

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by rescuz at 2015-04-15 14:34:43
我尝试处理过,可是最后发现还是有基因组残余啊(用引物pcr),而且最后RNA量似乎很低了。...

那我就帮不了你了,我的经验有限

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

4楼2015-04-15 15:57:56
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rescuz

金虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by clark2010 at 2015-04-15 15:57:56
那我就帮不了你了,我的经验有限...

求顶 啊
5楼2015-04-16 11:20:47
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