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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » DNA聚合反应求指导
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justsmiling

银虫 (小有名气)

[求助] DNA聚合反应求指导 已有2人参与

分子信标跟引物在聚合酶作用下将分子信标打开，为什么我做的引物跟分子信标的荧光值只能达到分子信标跟其互补链的30%，这个跟哪些因素有关呢
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1楼 2015-04-07 22:06:40
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

anglett

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-09 22:42:41
分子探针的序列，buffer,酶的活性及浓度，底物的量反应温度和时间，这些都是会影响荧光强度的。
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5楼2015-04-08 20:49:25
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anglett

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主，你的反应温度是多少，你的这两条链有点问题，你可以自己算下Tm值。
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8楼2015-04-08 21:44:40
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greeneese

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by justsmiling at 2015-04-08 21:18:49
MB是5’-TAMRA-CCTCTCCGTGTCTTGTACTTCCCGTCAGAGAGG-DABCYL-3’，引物链是5’-GACGGGAAG-3’ ，buf是
50mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM DTT，5mM MgCl2，250uM dNTP，酶我加终浓度为2U/100uL，MB200nM，引物300nM...

杂交和聚合的温度呢？

模拟显示在聚合酶最优工作温度37℃下这两条链的杂交比例很低。
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9楼2015-04-09 09:31:37
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greeneese

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-04-08 09:32:03
方便透露一下你用的链的序列吗？第一印象是你用的引物链不足以结合在分子信标上。
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2楼2015-04-08 08:32:51
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justsmiling

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by greeneese at 2015-04-08 08:32:51
方便透露一下你用的链的序列吗？第一印象是你用的引物链不足以结合在分子信标上。

我的链是以前师兄做过的，但是他能恢复到80%，我就只能到30%
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3楼2015-04-08 10:57:54
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greeneese

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by justsmiling at 2015-04-08 10:57:54
我的链是以前师兄做过的，但是他能恢复到80%，我就只能到30%...

那就是不方便透露你用的链的序列喽？

很难在不知道这种信息的情况下帮你。
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4楼2015-04-08 14:57:11
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justsmiling

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by greeneese at 2015-04-08 14:57:11
那就是不方便透露你用的链的序列喽？

很难在不知道这种信息的情况下帮你。...

MB是5’-TAMRA-CCTCTCCGTGTCTTGTACTTCCCGTCAGAGAGG-DABCYL-3’，引物链是5’-GACGGGAAG-3’ ，buf是
50mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM DTT，5mM MgCl2，250uM dNTP，酶我加终浓度为2U/100uL,MB是200nM,引物是300nM的浓度
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6楼2015-04-08 21:18:25
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justsmiling

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by anglett at 2015-04-08 20:49:25
分子探针的序列，buffer,酶的活性及浓度，底物的量反应温度和时间，这些都是会影响荧光强度的。

MB是5’-TAMRA-CCTCTCCGTGTCTTGTACTTCCCGTCAGAGAGG-DABCYL-3’，引物链是5’-GACGGGAAG-3’ ，buf是
50mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM DTT，5mM MgCl2，250uM dNTP，酶我加终浓度为2U/100uL，MB200nM，引物300nM
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7楼2015-04-08 21:18:49
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justsmiling

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by anglett at 2015-04-08 21:44:40
楼主，你的反应温度是多少，你的这两条链有点问题，你可以自己算下Tm值。

反应温度是37度，这个Tm值是MB的Tm值还是杂交后的Tm值？
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10楼2015-04-09 12:28:24
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