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qinxiao5566

银虫 (初入文坛)

[求助] miRNA反转引物及定量引物设计 已有1人参与

目前需要做些关于miRNA的实验，看了很多文献，但是感觉差距很大，里面很多东西让人凌乱啊！希望大虾能够帮忙解惑
1、miRNA的反转引物设计中，有固定的序列，在这序列后面加上的部分成熟miRNA碱基数目需要时多少（我看很多人添加的数目不同，因此想确认下）？
2、定量引物的设计中通用引物在不同的物种中相同吗？我对比了几个，发现其中大部分碱基序列相同。
3、U6作为内参基因，这个基因的扩增使用的是用miRNA茎环引物反转吗，或者还是通过其他方法。
希望各位能够指导一下，不胜感激。
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1楼 2015-03-18 15:48:00
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cd_lilidan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-06-24 12:17:20
我最近也是做这方面的，咱们互相交流
1.逆转录引物我的是通用的茎环序列后面加上相应的microRNA3‘末端六个碱基的反向互补序列，看其他的有七个或者八个的
2.下游通用引物是逆转录茎环引物的一部分
3.U6的逆转录，我用的是文献中查到的引物序列，跟microRNA是不同的
希望能有所帮助
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2楼2015-04-10 10:52:43
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zszhxmc

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cd_lilidan at 2015-04-10 11:52:43
我最近也是做这方面的，咱们互相交流
1.逆转录引物我的是通用的茎环序列后面加上相应的microRNA3‘末端六个碱基的反向互补序列，看其他的有七个或者八个的
2.下游通用引物是逆转录茎环引物的一部分
3.U6的逆转 ...

你好，看到你在做miRNA的工作，想请教几个问题
1.不知有没有过表达过miRNA在细胞中，如果自己构建过表达载体的话，如何克隆包含miRNA前体的DNA片段呢？是直接从基因组上miRAN前提上下游 增加100~200bp进行扩增就可以吗？
2.是不是miRNA的抑制载体，自己做不了，只能从公司来购买？
3.如果做miRNA的过表达稳转细胞系的话，载体使用慢病毒最好吗？我现在用的pmR-ZsGreen1这个质粒，打算做稳转，不知咋样

多谢多谢
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能力满足得了欲望的时候再开口~
3楼2015-06-24 11:09:29
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