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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » miRNA反转录总是效果很差
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machao8405

木虫 (正式写手)

[求助] miRNA反转录总是效果很差

miRNA反转录总是效果很差，加尾法试过10条miRNA只有1个引物凑合能用，茎环法14条miRNA只有3条引物能用，试验做不下去了，谁能有效的帮我设计一下引物啊？我的试验材料是小麦。
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1楼 2013-03-14 17:42:59
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这是马甲

至尊木虫 (著名写手)

谁的马甲都不是

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-17 16:38:29
我做的是动物的~~~
我也是用的茎环结构的反转引物，不知道楼主所说的效果很差是什么意思，动物上反转引物的设计有固定的通用序列，再加上几个miRNA特有的碱基即可，我反转了10来个，效果都还不错
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这是一只什么都不懂的马甲~~~
2楼2013-09-17 09:17:36
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machao8405

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 这是马甲 at 2013-09-17 09:17:36
我做的是动物的~~~
我也是用的茎环结构的反转引物，不知道楼主所说的效果很差是什么意思，动物上反转引物的设计有固定的通用序列，再加上几个miRNA特有的碱基即可，我反转了10来个，效果都还不错

试验已经顺利完成了
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3楼2013-09-17 20:53:45
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Myre-Y0Y0

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by machao8405 at 2013-09-17 20:53:45
试验已经顺利完成了...

卤煮咋做的、我用的茎环引物反转录，可是我的目的条带相当不亮啊、microRNA的反转录和其他的反转录有什么区别么？
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4楼2013-09-18 08:33:30
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Myre-Y0Y0

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 这是马甲 at 2013-09-17 09:17:36
我做的是动物的~~~
我也是用的茎环结构的反转引物，不知道楼主所说的效果很差是什么意思，动物上反转引物的设计有固定的通用序列，再加上几个miRNA特有的碱基即可，我反转了10来个，效果都还不错

我的也是动物的、我用的也是茎环引物、可是我的目的条带正常PCR出来就条带很弱、我想知道我的问题出在哪里了、小RNA的反转录和正常的RNA有什么不同么？我的内参却很亮，溶解曲线也很正常。。我快崩溃了。。。
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5楼2013-09-18 08:37:52
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machao8405

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Myre-Y0Y0 at 2013-09-18 08:37:52
我的也是动物的、我用的也是茎环引物、可是我的目的条带正常PCR出来就条带很弱、我想知道我的问题出在哪里了、小RNA的反转录和正常的RNA有什么不同么？我的内参却很亮，溶解曲线也很正常。。我快崩溃了。。。...

应该是表达量低的缘故吧
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6楼2013-09-18 08:50:48
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machao8405

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Myre-Y0Y0 at 2013-09-18 08:33:30
卤煮咋做的、我用的茎环引物反转录，可是我的目的条带相当不亮啊、microRNA的反转录和其他的反转录有什么区别么？...

普通RNA反转录用的是随机引物，即里面的所有RNA都发转录，颈环法只反转录出来目的小RNA，你的条带不亮可能是表达量本来就低或者本身分子量很小，本来就没法跟大的RNA相比
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7楼2013-09-18 08:53:21
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Myre-Y0Y0

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by machao8405 at 2013-09-18 08:53:21
普通RNA反转录用的是随机引物，即里面的所有RNA都发转录，颈环法只反转录出来目的小RNA，你的条带不亮可能是表达量本来就低或者本身分子量很小，本来就没法跟大的RNA相比...

那就是说、我的条带不亮是表达量低的原因，结果是正常的么？只要条带是特意条带就可以了嘛？
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8楼2013-09-18 10:07:31
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Myre-Y0Y0

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by machao8405 at 2013-09-18 08:53:21
普通RNA反转录用的是随机引物，即里面的所有RNA都发转录，颈环法只反转录出来目的小RNA，你的条带不亮可能是表达量本来就低或者本身分子量很小，本来就没法跟大的RNA相比...

还有就是茎环反转录，你和内参是一起反转录的，还是分开转的？
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9楼2013-09-18 10:11:49
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machao8405

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Myre-Y0Y0 at 2013-09-18 10:11:49
还有就是茎环反转录，你和内参是一起反转录的，还是分开转的？...

最好一起，如果两个引物互相没影响的话
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10楼2013-09-18 17:42:52
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