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xzhfood

荣誉版主 (著名写手)

[求助] 重叠PCR引物设计已有1人参与

片段1
TATAGGGAGAGGATCCCCCGCCGGCCACAGCGGCGGCCGGGTGGTCGATAAGGCGTCGCCCGGATTCTTCGGGATCTATACGGTCGGGGTGGCCAGTCCTGCTGTTGCCGGGCACGCGAGTGTCCGGCCCTCCGAGGTGCGGTGGTTGTGGTGAGAAGCACGTACCTGTACCGGGTGCTGAAGGCGAGCTGGGGTGTGCGCGTGCTCCTGGGCGCCGAGGCCCGCGGCGGCACGCCGGAACCCGATGCGGTGGCCGTGGCGGACGGCCTGTTCGTCCTTGACGCCACGGACGGTGTCGGGCTGTCGCCGGAGCAGATGCGGATGCTCGTCACGGGCCTCGGGCTGGTCGCCGCGGAGATCGTGAACGCGGTGCCGGAGCTGCCGGTCACCGTCGCGATCCAGGACGTCGAGGAGAACATGATGGACTATCAGGACGAGGGCATGGCCGCGGCGGTCCTCGGCTGGGCGATCAACGAGTTCGGGCTGCCGCCGCGGGAGATTCCGGTGACGTACCTCAGCGTCGAGCGGCGGTACGTCTTCGACTTCGACGCGGTGCGACCGGCCGGCTGATCCGGTCAGGTGCACGATGGAGAGAAGCGGCCGGAGGGCCGGCTCACCGGAAGGTGTAGTCGG

片段2
CCGAACACGCCATCACCCCGACGCTGCCGATGCCCGGCGCCGTGGAGGCCCTCGCGGCGGTGCGCGCCCTCGGACTGCGGGTGGTGGTGGTCACCTCGAAGATCGGCCGGCTCGCCGAGATGCACCTGGCCCACCTCGGGATGGCCGCCGATGAGCTGGCCGGTGACCTGTTCGCCGAGGGCAAGGCCGCCGCGGTGACCGAGCACGGGGTGCGGTGGTACGTCGGCGACCACGTCGGGGACATGATCGCCGCCCGGACCGCCGGCGTGCCCGGGATCGGCGTCACCACCGGTCCGTGCGCTGCTGACGAGCTGTGGGCGGCTGGTGCGTCGTCCGTGATTCCGGACCTTCTCGCCCTGCCCGGTTTGTTGCGGGAGATAACGGTTGGGCCCGGACCGGAAGGGTCGATAGCCTTGAGGCCACGTTCCAGCGAATGAGTTGAGGTCAGCGGTGCCCACGGGTCGAGTGAAGTGGTACGACGCGACGAAGGGATTCGGATTCG TCACCAGTGACGAGGGCGGGGATGTCTTCCTGCCCAAGGGCGCGCTGCCGGCCGGCGTGGCCGAGCTCAAGAC


重叠PCR和融合PCR是一样的概念吗?谢谢。

将这两段DNA连接起来

要求在片段1引物中加入酶切位点(NheI,GCTAGC)和(PmeI,GTTTAAAC),在片段2引物中加入酶切位点(PmeI,GTTTAAAC)和(SphI,GCATGC)
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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不用加PmeI的酶切位点,只要在片段1的下游引物上在延伸出20BP到片段2,在片段2的上游引物上在延伸出20BP到片段1。在把两个片段千倍稀释,放在一个PCR管里,加片段1的上游,和片段2的下游,就能批出整条链了。你加酶切位点的话还的算哪多出来的几个碱基,3片段连接也不是和好连。
采菊东篱下,悠然见南山。
2楼2015-01-28 09:29:37
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xzhfood

荣誉版主 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 781055707 at 2015-01-28 09:29:37
不用加PmeI的酶切位点,只要在片段1的下游引物上在延伸出20BP到片段2,在片段2的上游引物上在延伸出20BP到片段1。在把两个片段千倍稀释,放在一个PCR管里,加片段1的上游,和片段2的下游,就能批出整条链了。你加酶 ...

谢谢,如何设计引物?OVERLAP PCR原理我明白了,这两段DNA的引物怎么设计出来?
3楼2015-01-28 09:34:31
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xzhfood at 2015-01-28 09:34:31
谢谢,如何设计引物?OVERLAP PCR原理我明白了,这两段DNA的引物怎么设计出来?...

就多加20BP呀,其他的就和一般的引物一样了,也就是说你会有2对40多BP的引物。
采菊东篱下,悠然见南山。
4楼2015-01-28 09:46:15
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xzhfood

荣誉版主 (著名写手)

F1-FOR (NheI): GCGCGCTAGCGCGGTGGTTGTGGTGAGAAGC
F2-REW (PmeI):GTCGGGGTGATGGCGTGTTCGGTTTAAACCCGACTACACCTTCCGGTGAG
and
F3-FOR (PmeI):CTCACCGGAAGGTGTAGTCGGGTTTAAACCGAACACGCCATCACCCCGAC
F4-REW (SphI):GCGCGCATGCCGAATCCGAATCCCTTCGTCG
5楼2015-01-28 11:15:00
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