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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 农林 » 农林综合 » 求助土壤酸性磷酸酶活性测定的详细方法~~~
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jingxuegood

新虫 (正式写手)

[求助] 求助土壤酸性磷酸酶活性测定的详细方法~~~ 已有4人参与

试验需要测定土壤酸性磷酸酶活性，想用对硝基苯磷酸二钠比色法，但查到的方法不够详细。有的说要每个样品都要做空白对照，有点没有提及这点；关于标准曲线的测定时加入的试剂也不尽相同，现在很是混乱。望做过相关试验的人士给予详细方法和相关指点，非常感谢！！！
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1楼 2015-01-26 20:12:29
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macjr

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jingxuegood at 2015-01-27 20:25:59
你好，感谢回复。我想问一下，你说的“酸性磷酸酶最后的反应液反应条件是在碱性环境下的”是什么意思呀？缓冲液pH是多少呀？用PNPP做基质，醋酸-醋酸钠做缓冲液时，测定标准曲线都需要加入什么试剂呢？有点混乱，能 ...

土壤磷酸酶（酸性）
（一）试剂
1. pH5醋酸盐缓冲液：
A:0.2mol/L 醋酸溶液（11.55ml稀释至1000ml）
B:0.2mol/L醋酸钠溶液 A液14.8ml+B液35.2ml稀释至100ml
2. 0.5%磷酸苯二钠：pH5醋酸缓冲液
3. 氯代二溴对苯醌亚胺：称取0.125g 2，6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇（48ml乙醇+2ml水）溶解，贮存于棕色瓶中，存放在冰箱中，保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
4. 酚标准溶液：酚原液---取1g苯酚溶于蒸馏水中，定容至1000ml水中，保存于棕色瓶中。酚工作液---取10ml酚原液稀释至1000ml水中，每毫升含0.01mg酚
5. 甲苯
6. pH9.4硼酸缓冲液：A液：0.05mol/L硼砂 B液：0.2mol/L氢氧化钠
A液50ml+B液11ml 稀释至200ml
（二）实验步骤
1. 标线制作
取0，1，3，5，7，9，11，13ml酚工作液，置于50ml比色管中，加入5ml缓冲液（pH9.4硼酸缓冲液）和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定于660nm波长下测定吸光度。
2. 样品测定
称取风干土样（过1mm筛，去除杂质）2.0000g，放置于100ml离心管中，加1ml甲苯，15min后加入20ml 0.5%磷酸苯二钠，仔细摇匀后放置于37°C恒温箱中陪养24h，后培养液中加入50ml蒸馏水离心过滤。吸取滤液1ml于50ml比色管中，按标准曲线方法显色，并测定吸光度。
同时做空白实验和每一土样的无基质对照
（三）数据计算
以24小时每克土壤中释放出酚的毫克数表示
我的方法
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jingxuegood
4楼2015-01-28 09:12:37
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macjr

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by leoabby at 2015-03-26 17:53:43
追问，配制缓冲液的时候需要准确调ph值么？...

不需要啊。按照提示的配置就是了。基本上不会有问题。
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8楼2015-03-26 20:52:30
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leoabby

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by leoabby at 2015-03-27 10:31:08
因为样品比较多，所以就没有每个样品都做无基质对照，每三个平行我只做了一个对照，会不会有问题啊？...

无基质对照是用不加磷酸苯二钠的缓冲液还是单纯蒸馏水啊？因为做土样的时候加的磷酸苯二钠是用缓冲液配的，所以我考虑无基质的是不是单纯用缓冲液？还是只用蒸馏水就好了？谢谢啦！
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好好学习，天天向上。
11楼2015-03-27 19:12:06
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普通回帖

macjr

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jingxuegood: 金币+2, ★有帮助 2015-01-27 20:26:18
不是空白对照，是无基质对照。。每个土样都必须，其实网络上的方法都一样，酸性磷酸酶最后的反应液反应条件是在碱性的环境下的
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2楼2015-01-27 09:22:01
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jingxuegood

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by macjr at 2015-01-27 09:22:01
不是空白对照，是无基质对照。。每个土样都必须，其实网络上的方法都一样，酸性磷酸酶最后的反应液反应条件是在碱性的环境下的

你好，感谢回复。我想问一下，你说的“酸性磷酸酶最后的反应液反应条件是在碱性环境下的”是什么意思呀？缓冲液pH是多少呀？用PNPP做基质，醋酸-醋酸钠做缓冲液时，测定标准曲线都需要加入什么试剂呢？有点混乱，能不能给我发一份详细的测定方法呢？非常感谢～～～

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2015-01-27 20:25:59
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jingxuegood

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by macjr at 2015-01-28 09:12:37
土壤磷酸酶（酸性）
（一）试剂
1. pH5醋酸盐缓冲液：
A:0.2mol/L 醋酸溶液（11.55ml稀释至1000ml）
B:0.2mol/L醋酸钠溶液 A液14.8ml+B液35.2ml稀释至100ml
2. 0.5%磷酸苯二钠：pH5醋酸缓冲液
3. 氯代二溴对 ...

收到，非常感谢！只是我想用PNPP（对硝基苯磷酸二钠）做基质~~~
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5楼2015-01-29 10:42:55
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jingxuegood

新虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by macjr at 2015-01-28 09:12:37
土壤磷酸酶（酸性）
（一）试剂
1. pH5醋酸盐缓冲液：
A:0.2mol/L 醋酸溶液（11.55ml稀释至1000ml）
B:0.2mol/L醋酸钠溶液 A液14.8ml+B液35.2ml稀释至100ml
2. 0.5%磷酸苯二钠：pH5醋酸缓冲液
3. 氯代二溴对 ...

说你的回帖“不是应助回帖，您不能对此进行金币奖励”，所以以送红花的形式答谢吧，~~~
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6楼2015-01-29 10:45:08
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leoabby

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by macjr at 2015-01-28 09:12:37
土壤磷酸酶（酸性）
（一）试剂
1. pH5醋酸盐缓冲液：
A:0.2mol/L 醋酸溶液（11.55ml稀释至1000ml）
B:0.2mol/L醋酸钠溶液 A液14.8ml+B液35.2ml稀释至100ml
2. 0.5%磷酸苯二钠：pH5醋酸缓冲液
3. 氯代二溴对 ...

追问，配制缓冲液的时候需要准确调ph值么？
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好好学习，天天向上。
7楼2015-03-26 17:53:43
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leoabby

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by macjr at 2015-03-26 20:52:30
不需要啊。按照提示的配置就是了。基本上不会有问题。...

因为样品比较多，所以就没有每个样品都做无基质对照，每三个平行我只做了一个对照，会不会有问题啊？
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好好学习，天天向上。
9楼2015-03-27 10:31:08
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macjr

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by leoabby at 2015-03-27 10:31:08
因为样品比较多，所以就没有每个样品都做无基质对照，每三个平行我只做了一个对照，会不会有问题啊？...

有，必须每一个样品做一个无基质对照。。每一个土壤
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10楼2015-03-27 14:51:25
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