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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于基因和质粒连接后质粒大小问题
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linxiaolin08

捐助贵宾 (初入文坛)

[求助] 关于基因和质粒连接后质粒大小问题 已有2人参与

最近我在做目的基因与28a质粒双酶切后连接，连接后转化提取质粒，发现质粒的构型改变了，我的基因1100bp，加上28a质粒应该是6500bp左右，正常跑电泳应该在超螺旋Marker中间最亮的那条带之上，但是我跑出来的图片是在那条带之下。我还是酶切验证了，结果居然是有目的基因条带切出来....我想问一下基因跟质粒连接后会造成质粒的超螺旋更加超螺旋么？我只能想出这么一个理由了...那会影响蛋白表达么？
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1楼 2014-12-25 20:13:04
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mumu624

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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linxiaolin08: 金币+5 2015-01-05 08:58:25
这和你用的琼脂糖胶的浓度有关系，这种验证片段是否连接上的实验，当你使用的是没有酶切的超螺旋质粒跑胶时，建议你跑一个空载的超螺旋质粒做对照，对你的片段大小来说，在同一块胶上应该可以看出空载与连接上的质粒大小有所区别，也就不会出现令你的疑惑德现象了。
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3楼2014-12-26 18:05:41
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枭翔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-26 16:49:20
linxiaolin08: 金币+5 2015-01-05 08:58:22
放心吧，楼主，不会让你的质粒更加超螺旋的。首先，解释一下为什么插入目的基因以后为什么条带更向下了。重组质粒是不是没有酶切而直接跑的电泳？如果是的话，那就对了。因为超螺旋的质粒跑的位置会比实际大小偏向下一点。还有就是，就算是重组质粒你单酶切了，跑的位置也不一定就跟你的marker完全对应，我遇见过。遇到这种情况，我建议楼主继续往下做，酶切验证以后，测序看看。希望能够有用。
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2楼2014-12-25 20:29:39
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linxiaolin08

捐助贵宾 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 枭翔 at 2014-12-25 20:29:39
放心吧，楼主，不会让你的质粒更加超螺旋的。首先，解释一下为什么插入目的基因以后为什么条带更向下了。重组质粒是不是没有酶切而直接跑的电泳？如果是的话，那就对了。因为超螺旋的质粒跑的位置会比实际大小偏向下 ...

谢谢    我会继续做的  也送去测序了   谢谢啦！！！
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4楼2015-01-05 08:57:46
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