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380218013

金虫 (小有名气)

应助: 14 (小学生)
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虫号: 1185569
注册: 2011-01-07
性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 关于GS115酵母转化问题

大家好：
   小弟最近在做酵母表达蛋白实验。结果转化后总是没有克隆长出，很是郁闷。实验步骤如下，请大神指教。
感受态的制备：
      1. 挑去单克隆GS115于50 mL YPD培养基中，30℃过夜。
      2. 取500 ul 菌液加入到500 ML YPD培养基中，培养24 h左右，测OD600
      3. 当OD600在1. 3-1.5 时，1500 g 5 min 离心，500 ml 冰灭菌水重悬
      4.  1500 g 5 min 离心，250 ml 冰灭菌水重悬
      5. 1500 g 5 min 离心，20  ml 冰1 M 山梨醇重悬
      6.1500 g 5 min 离心，1  ml 冰1 M 山梨醇重悬（很粘稠）
      7. 100 ul每管分装，-80 保存。
质粒的制备：
      1： BstXI 单酶切20 ug质粒，使质粒线性化，同时加去磷酸化酶 37℃  4 h
      2.  热灭活，天根回收试剂盒回收质粒DNA。
转化：
   1.  100 ul 感受态+ 线性化的质粒40 ul 转入到0.2 cm预冷的电击杯中
   2.  1500 V  25 uF  电阻 200 ，电击
   3.  取电击液体加入到YPDS平板中（含100 ug/mL zeocine），涂布，30℃培养。

结果五天仍无克隆长出。（另，因为在别的地方做实验，感受态从-80度拿出来后放在冰上约4h 后实验。）

请大神指点迷津。谢谢

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