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380218013金虫 (小有名气)
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[求助]
关于GS115酵母转化问题
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大家好： 小弟最近在做酵母表达蛋白实验。结果转化后总是没有克隆长出，很是郁闷。实验步骤如下，请大神指教。 感受态的制备： 1. 挑去单克隆GS115于50 mL YPD培养基中，30℃过夜。 2. 取500 ul 菌液加入到500 ML YPD培养基中，培养24 h左右，测OD600 3. 当OD600在1. 3-1.5 时，1500 g 5 min 离心，500 ml 冰灭菌水重悬 4. 1500 g 5 min 离心，250 ml 冰灭菌水重悬 5. 1500 g 5 min 离心，20 ml 冰1 M 山梨醇重悬 6.1500 g 5 min 离心，1 ml 冰1 M 山梨醇重悬（很粘稠） 7. 100 ul每管分装，-80 保存。 质粒的制备： 1： BstXI 单酶切20 ug质粒，使质粒线性化，同时加去磷酸化酶 37℃ 4 h 2. 热灭活，天根回收试剂盒回收质粒DNA。 转化： 1. 100 ul 感受态+ 线性化的质粒40 ul 转入到0.2 cm预冷的电击杯中 2. 1500 V 25 uF 电阻 200 ，电击 3. 取电击液体加入到YPDS平板中（含100 ug/mL zeocine），涂布，30℃培养。 结果五天仍无克隆长出。（另，因为在别的地方做实验，感受态从-80度拿出来后放在冰上约4h 后实验。） 请大神指点迷津。谢谢 |
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