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380218013金虫 (小有名气)
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[求助]
关于GS115酵母转化问题
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大家好: 小弟最近在做酵母表达蛋白实验。结果转化后总是没有克隆长出,很是郁闷。实验步骤如下,请大神指教。 感受态的制备: 1. 挑去单克隆GS115于50 mL YPD培养基中,30℃过夜。 2. 取500 ul 菌液加入到500 ML YPD培养基中,培养24 h左右,测OD600 3. 当OD600在1. 3-1.5 时,1500 g 5 min 离心,500 ml 冰灭菌水重悬 4. 1500 g 5 min 离心,250 ml 冰灭菌水重悬 5. 1500 g 5 min 离心,20 ml 冰1 M 山梨醇重悬 6.1500 g 5 min 离心,1 ml 冰1 M 山梨醇重悬(很粘稠) 7. 100 ul每管分装,-80 保存。 质粒的制备: 1: BstXI 单酶切20 ug质粒,使质粒线性化,同时加去磷酸化酶 37℃ 4 h 2. 热灭活,天根回收试剂盒回收质粒DNA。 转化: 1. 100 ul 感受态+ 线性化的质粒40 ul 转入到0.2 cm预冷的电击杯中 2. 1500 V 25 uF 电阻 200 ,电击 3. 取电击液体加入到YPDS平板中(含100 ug/mL zeocine),涂布,30℃培养。 结果五天仍无克隆长出。(另,因为在别的地方做实验,感受态从-80度拿出来后放在冰上约4h 后实验。) 请大神指点迷津。谢谢 |
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