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qingfeng2011

金虫 (正式写手)

[求助] 酵母双杂求助-质粒在酵母中的表达(Gal4系统) 已有4人参与

亲爱的各位虫友,本人最近在做酵母双杂验证两个蛋白的互作,是将2个质粒依次转到AH109 中的,所用载体为pGBKT7 和pGADT7。在缺色氨酸和亮氨酸的SD培养基上能长出单菌落,并且PCR验证两个质粒都已转入。但是四缺板加JA-Ile(只有加入这种物质才可发生互作)后并没有菌落生长。
对于这种原因,自己也进行了以下分析,可能 蛋白并没有表达。但是有一篇Nature就做出来了,只不过我们用的载体的差别在于他们用的是Gateway系统,我们是普通的载体,载体名称都是一样的。非常困惑,请各位虫友帮忙解答!万分感谢!
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你检测一下你的插入片段读码框是否改变。
hehe
2楼2014-12-21 08:47:16
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君酷

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR怎么能确定是否转入?不转入难道就P不出来了吗?

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-12-21 10:24:05
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这两个载体中都有标签的吧,而且标签和你的目的蛋白是融合的,你抽提蛋白做下western看下你的蛋白有没有表达就OK了,还有,做双杂的时候带上正对照,这样就可以知道是否是你的双杂系统有问题了。从这两个方面找问题吧。
4楼2014-12-22 19:57:57
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enhen122333

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你的茉莉酸异亮氨酸从哪里买的?
5楼2016-07-02 15:06:28
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