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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 酵母双杂求助-质粒在酵母中的表达（Gal4系统）
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qingfeng2011

金虫 (正式写手)

[求助] 酵母双杂求助-质粒在酵母中的表达（Gal4系统） 已有4人参与

亲爱的各位虫友，本人最近在做酵母双杂验证两个蛋白的互作，是将2个质粒依次转到AH109 中的，所用载体为pGBKT7 和pGADT7。在缺色氨酸和亮氨酸的SD培养基上能长出单菌落，并且PCR验证两个质粒都已转入。但是四缺板加JA-Ile（只有加入这种物质才可发生互作）后并没有菌落生长。
对于这种原因，自己也进行了以下分析，可能 蛋白并没有表达。但是有一篇Nature就做出来了，只不过我们用的载体的差别在于他们用的是Gateway系统，我们是普通的载体，载体名称都是一样的。非常困惑，请各位虫友帮忙解答！万分感谢！
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1楼 2014-12-20 23:30:33
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你检测一下你的插入片段读码框是否改变。
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hehe
2楼2014-12-21 08:47:16
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君酷

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR怎么能确定是否转入？不转入难道就P不出来了吗？

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-12-21 10:24:05
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这两个载体中都有标签的吧，而且标签和你的目的蛋白是融合的，你抽提蛋白做下western看下你的蛋白有没有表达就OK了，还有，做双杂的时候带上正对照，这样就可以知道是否是你的双杂系统有问题了。从这两个方面找问题吧。
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4楼2014-12-22 19:57:57
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enhen122333

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你的茉莉酸异亮氨酸从哪里买的？
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5楼2016-07-02 15:06:28
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