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12一笑而过

金虫 (小有名气)

[求助] 如何鉴定蛋白质的纯度 已有3人参与

前段时间一直在做蛋白质的分离纯化,蛋白是重组乙酰胆碱酯酶,分子量大概为70kDa。采用的是强阴离子交换法纯化的,纯化后电泳呈单条带,后将样品送去南京一家生物公司进行具体的纯度鉴定,采用的方法是高效液相色谱。现得到液相图谱,本人没做过液相,看不懂结果也没办法分析,还请各位大神帮我分析分析。具体图谱如附件,在此先谢谢各位大神了~~~~~~~~~~~~~PS:个人感觉这物质峰是不是没有完全分离开呀?还有拿到这样的结果纯度该怎样计算?
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科研之路很艰辛,但我会坚强的走下去的!给自己加油!
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皇猪

木虫 (正式写手)

你为什么不用重组乙酰胆碱酯酶标品做一个HPLC图呢,这样一对比就知道哪些峰是杂峰,哪些是重组乙酰胆碱酯酶的峰了
没有梦想,那跟咸鱼有什么分别
3楼2014-12-11 09:38:33
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普通回帖

皇猪

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
12一笑而过: 金币+20, ★★★很有帮助 2014-12-13 10:15:14
蛋白不纯,有杂峰出现。另外,我对你的重组乙酰胆碱酯酶的分子结构不了解,所以不确定HPLC峰图中是不是有重组乙酰胆碱酯酶降解而引起杂峰的存在。你的重组乙酰胆碱酯酶大概在13-15min间被检测出来.这个公司用的PMP1 溶剂B无法检测你的重组乙酰胆碱酯酶。对了,他们公司用的是什么柱子做HPLC检测的???怎么峰图中没有标出呀???

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

没有梦想,那跟咸鱼有什么分别
2楼2014-12-11 09:10:05
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皇猪

木虫 (正式写手)

你没做个标品图,纯度多少应该很难算吧,建议先做个标品的HPLC,这样好比对计算些。。
没有梦想,那跟咸鱼有什么分别
4楼2014-12-11 09:41:41
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12一笑而过

金虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 皇猪 at 2014-12-11 09:10:05
蛋白不纯,有杂峰出现。另外,我对你的重组乙酰胆碱酯酶的分子结构不了解,所以不确定HPLC峰图中是不是有重组乙酰胆碱酯酶降解而引起杂峰的存在。你的重组乙酰胆碱酯酶大概在13-15min间被检测出来.这个公司用的PMP1 ...

非常感谢您的回复。重组乙酰胆碱酯酶没有标品所以没有跑标品,公司用的柱子是Zorbax SB-C18  4.6 X 250  5 um  (Agilent .USA)。连空白都木有跑的,根本不清楚哪些是溶剂峰。觉得被公司坑了,报告结果就这么一张图谱,压根就没办法说明蛋白纯度。你所说的“这个公司用的PMP1 溶剂B无法检测你的重组乙酰胆碱酯酶。”这句话我该如何理解?
科研之路很艰辛,但我会坚强的走下去的!给自己加油!
5楼2014-12-13 10:13:51
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静待一片天yu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
12一笑而过: 金币+2, 有帮助 2014-12-19 22:07:17
可以尝试下sds-page法,然后运用软件算纯度.祝好运!
6楼2014-12-14 22:47:41
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12一笑而过

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 静待一片天yu at 2014-12-14 22:47:41
可以尝试下sds-page法,然后运用软件算纯度.祝好运!

做过SDS-PAGE的,电泳呈单条带,才送去公司做具体的纯度鉴定的。电泳有一些浓度很低的杂蛋白是跑不出条带的,所以计算出来的纯度肯定是不准确的,我接下来的实验对蛋白纯度要求很高,所以要准确知道蛋白纯度,所以才送去公司鉴定的,不想到结果这样。
科研之路很艰辛,但我会坚强的走下去的!给自己加油!
7楼2014-12-15 10:07:42
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lifelovewei

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
12一笑而过: 金币+2, 有帮助 2014-12-19 22:07:42
可是这个这么杂 怎么可能是纯品?我们做的重组没有过这么多峰型的70K 用c4 差不多,c18很容易堵
8楼2014-12-15 10:18:10
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12一笑而过

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by lifelovewei at 2014-12-15 10:18:10
可是这个这么杂 怎么可能是纯品?我们做的重组没有过这么多峰型的70K 用c4 差不多,c18很容易堵

我有跟公司讲过分子量比较大,要他们用C4或C8柱做纯度分析,但是他们还是用了C18柱,不知道为啥分析出来的结果会这样,即便我的蛋白纯度不是很高,但最起码电泳已经是单一条带了,也不可能这么杂的,不知道公司是怎么搞的。
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9楼2014-12-19 22:06:44
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超级219

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 12一笑而过 at 2014-12-15 10:07:42
做过SDS-PAGE的,电泳呈单条带,才送去公司做具体的纯度鉴定的。电泳有一些浓度很低的杂蛋白是跑不出条带的,所以计算出来的纯度肯定是不准确的,我接下来的实验对蛋白纯度要求很高,所以要准确知道蛋白纯度,所以 ...

同学你好,想问下,SDS-PAGE条带跑出来后,怎么计算纯度啊,多谢。
10楼2016-01-10 17:45:09
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