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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 色谱质谱 » HPLC 用C18反相柱鉴定蛋白纯度，蛋白峰与溶剂峰混在一起怎么办？
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minmin-911

铜虫 (小有名气)

[求助] HPLC 用C18反相柱鉴定蛋白纯度，蛋白峰与溶剂峰混在一起怎么办？ 已有1人参与

用HPLC C18反相柱鉴定纯化蛋白质纯度，如图所示，是不是我的目标蛋白的极性太强，导致与溶剂峰混在一起，出峰太早？28min的峰为流动相的峰。那该怎么解决这个问题呢？菜鸟求救啊！
图1为空白对照： Tris-HCL 含NaCl 0.12M (pH 7.2)
图2为样品溶于Tris-HCL 含NaCl 0.12M (pH 7.2)

HPLC柱子：C18, 4.6 mm × 250 mm, 300 A
洗脱液：
Solvent A，1%乙酸水溶液
Solvent B，100%甲醇
洗脱条件：
0-10min 10%-30% B
10-20min 30%-70% B
20-40min 70% B
流速为 1.0 ml/min
检测波长为：280 nm
目标蛋白分子量为25KDa, pI为5左右。

图1 对照.jpg



图2 样品.jpg
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1楼 2012-10-30 16:47:08
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小娜-小宇

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
听不到: 金币+1, 感谢您的解答，欢迎常来分析版 2012-10-31 10:19:08
可以正相色谱分析呀，跑反相受溶剂峰影响分离度明显很低，根本说是分不开的呀。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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少吃多滋味，保持微笑
2楼2012-10-30 21:34:50
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minmin-911

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小娜-小宇 at 2012-10-30 21:34:50
可以正相色谱分析呀，跑反相受溶剂峰影响分离度明显很低，根本说是分不开的呀。

那如果2-6min之间的那些小峰会不会是我的蛋白峰呢？
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3楼2012-10-31 10:15:02
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小娜-小宇

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

跑个标准品吧。就确定几分出峰了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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少吃多滋味，保持微笑
4楼2012-10-31 13:29:32
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刘小益

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得如果是你的蛋白质极性太强，你可以试着往流动相中加入一些离子对试剂，如TFA等，对于蛋白质的保留时间跟峰型都有较大的影响。同时对于蛋白质的检测波长，建议使用214nm，这个为酰胺键的吸收峰，对于蛋白质这个位置的吸收更强~~
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实验室小打杂
5楼2012-10-31 14:56:13
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liuwei10987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用的多大孔径的柱子，这么大的结构可能过不了柱子，量大了还会堵柱子。
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6楼2012-11-01 23:20:51
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zhangrj920

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

一般流动相B都用100%乙腈啊，换一下梯度。为了更好地分离纯化,必须对其分离条件再次进行优化。首先,对其分离梯度模式进行选择,
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7楼2013-03-22 10:57:44
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jixiaoman12

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 刘小益 at 2012-10-31 14:56:13
我觉得如果是你的蛋白质极性太强，你可以试着往流动相中加入一些离子对试剂，如TFA等，对于蛋白质的保留时间跟峰型都有较大的影响。同时对于蛋白质的检测波长，建议使用214nm，这个为酰胺键的吸收峰，对于蛋白质这个 ...

请教你一个有关色谱柱的问题 凝胶色谱柱TSKgel2000SWXL和C18蛋白柱在分析蛋白质上有什么不同吗
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8楼2014-08-23 17:01:21
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刘小益

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jixiaoman12 at 2014-08-23 17:01:21
请教你一个有关色谱柱的问题 凝胶色谱柱TSKgel2000SWXL和C18蛋白柱在分析蛋白质上有什么不同吗...

凝胶色谱柱是个体积排阻色谱柱，这种分离模式能很好的保持蛋白活性，也可以对蛋白进行质量分级，但是分离效果不好~C18柱分离效果比较好，但是蛋白保留太强，容易引起柱残留，有些蛋白会不可逆的被吸付，建议使用C4的反相柱~~
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实验室小打杂
9楼2014-08-23 21:54:55
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不爱叫外卖

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 刘小益 at 2014-08-23 21:54:55
凝胶色谱柱是个体积排阻色谱柱，这种分离模式能很好的保持蛋白活性，也可以对蛋白进行质量分级，但是分离效果不好~C18柱分离效果比较好，但是蛋白保留太强，容易引起柱残留，有些蛋白会不可逆的被吸付，建议使用C4 ...

学到了
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10楼2014-11-06 11:16:22
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