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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 化学分析 » 蛋白质的HPLC纯度分析
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zxg_4545

金虫 (小有名气)

[求助] 蛋白质的HPLC纯度分析 已有2人参与

想用HPLC看看CRP（25KD）的纯度，用C18，大口径的（300A）柱子行吗？蛋白质液相分析前需要做什么处理吗？各位做过蛋白HPLC的大侠给在下指导一下，谢谢！
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1楼 2013-10-30 16:13:02
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e_liang369

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
以前用agilent extend C8柱做过17.5kd的，处理时注意溶解，离心
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悲催的研发！
2楼2013-10-30 16:30:23
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e_liang369

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
release53: 金币+1, 感谢应助 2013-10-30 19:02:21
还要注意洗脱强度，有可能用乙腈洗脱能力都有限，当时我们流动相里掺了异丙醇来增强洗脱能力
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悲催的研发！
3楼2013-10-30 16:31:32
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liyiran1035

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

需要使用梯度 这样可以减小峰宽 增加分离度
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4楼2013-12-31 09:10:29
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cpn

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

lz,不要用C18了，蛋白很有可能在柱子上有强保留洗不下来。
用大孔径的C4或C8，流动相加水乙腈TFA，另外提高柱温改善拖尾。
蛋白液相分析前只要除掉颗粒型杂质就行了，可以用PES等低蛋白吸附的滤膜过滤下。
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5楼2013-12-31 11:04:27
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zxg_4545

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cpn at 2013-12-31 11:04:27
lz,不要用C18了，蛋白很有可能在柱子上有强保留洗不下来。
用大孔径的C4或C8，流动相加水乙腈TFA，另外提高柱温改善拖尾。
蛋白液相分析前只要除掉颗粒型杂质就行了，可以用PES等低蛋白吸附的滤膜过滤下。

恩，试过C4和C8的，不管用什么比例的流动相，都在3min左右出峰，感觉在柱子上没有保留啊。
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6楼2014-07-18 16:24:02
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cpn

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zxg_4545 at 2014-07-18 16:24:02
恩，试过C4和C8的，不管用什么比例的流动相，都在3min左右出峰，感觉在柱子上没有保留啊。...

有加甲酸或TFA么？水相有机相比例多少？
3min应该已经大于柱子的死时间了
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7楼2014-07-21 22:35:54
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zxg_4545

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cpn at 2014-07-21 22:35:54
有加甲酸或TFA么？水相有机相比例多少？
3min应该已经大于柱子的死时间了...

加了TFA的，水相有机相比例从高到低都换过，时间都是在3min左右。后来换了凝胶柱试了下，效果好多了。谢谢！
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8楼2014-07-25 15:38:58
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cpn

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zxg_4545 at 2014-07-25 15:38:58
加了TFA的，水相有机相比例从高到低都换过，时间都是在3min左右。后来换了凝胶柱试了下，效果好多了。谢谢！...

你的蛋白极性得有多大啊。。。
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9楼2014-07-26 00:16:37
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