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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 限制性内切酶问题
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飓飙小子

金虫 (正式写手)

[交流] 限制性内切酶问题 已有4人参与

我想问下 XhoI和KpnI-HF 这两个酶好用吗？我是把目的片段连接到载体上。目的片段P出来条带很亮，回收，双酶切，连接，转化，涂板，有20-30个单菌落。但是菌P,都是空载，阳性的P出来了，想问下哪里出了问题。
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说好的一起白头到老，你却偷偷焗了油。。。
1楼 2014-11-18 16:18:29
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一毫升的枪

新虫 (小有名气)
★
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你可以把PCR产物先连到T载体上后再从T载体上切下来，然后再与你的表达载体链接，这样应该就可以了。
我们实验室都是这么解决的
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3楼2014-11-19 15:10:19
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白色蜻蜓飞

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by 一毫升的枪 at 2014-11-19 15:10:19
你可以把PCR产物先连到T载体上后再从T载体上切下来，然后再与你的表达载体链接，这样应该就可以了。
我们实验室都是这么解决的

我也想问，为什么要和t载体连接切下来再和表达载体连接啊？不能直接连接导入嘛？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-11-21 10:52:17
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wygao2012

铜虫 (初入文坛)
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你确定载体好用吧，你这种情况一般是载体没有切好！还有就是要看看你的内切酶有没有失活。做菌落Pcr的时候直接用特异性引物p，这样结果更可靠！
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5楼2014-11-27 20:31:48
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
★
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1.片段酶切时间得久一点，我们都是6个小时左右，然后再纯化，连接
2.如果你用的是Taq酶的话可以直接做个TA cloning，这个很方便，你的片段不需要酶切就可以直接和T载体连接了，成功后再从质粒上将你的片段给切下来就行了。如果用的不是taq酶的话，载体可以用平端的。
3.现在我们在克隆都用无缝克隆了，个人觉得比酶切呀什么的方便多了，PCR结束后直接纯化，重组，半个小时搞定，很快，效率又高。
4.加油。
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6楼2014-11-28 00:29:32
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