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蓝色泡沫321

银虫 (初入文坛)

[求助] 有关限制性内切酶的用法 已有2人参与

我构建了T载体和目的基因的重组质粒,现在要进行双酶切获取目的基因,可是上下游用的酶速度不用,说明书上说一个只需要37度5min,另一个要37度16小时,而且两种酶的buffer也不一样,我要怎么建立酶切体系啊,两个酶和buffer是要一起加进去还是一个反应完在把另一个加进去
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
蓝色泡沫321(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-10 20:47:35
这种从载体上往下切最容易了,切完了跑个胶就一目了然了。如果你的酶质量好一点的话,在同一个体系里面切12 h是没啥问题的,可以先试试切过夜跑个胶回收。
2楼2014-06-10 16:36:31
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蓝色泡沫321

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2014-06-10 16:36:31
这种从载体上往下切最容易了,切完了跑个胶就一目了然了。如果你的酶质量好一点的话,在同一个体系里面切12 h是没啥问题的,可以先试试切过夜跑个胶回收。

可是我的两个酶所用的buffer是不一样的,在网上也没有找到可以共用的buffer,难道只能先切一个再沉淀换buffer吗
3楼2014-06-10 16:50:10
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
蓝色泡沫321(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-10 20:47:45
反应时间倒是不会影响太多

buffer的话,这个第一次听说不共用,一般用Takara的酶,有张表,总是可以配上的。如果实在配不上,你用green buffer,这个是个万能buffer

其实,你不妨试一下用其中一个buffer,毕竟酶切没那么多严格限制,选择buffer时,选用两种酶相对来说活性都很高的那一种就可以了,只不过是效率问题,效率低的话,多切会儿

另外,分步切也可以,不过效率没想象的高

另外,额外说一下,NEB的在线分析软件Double Digest Finder 不错。你想进行任意两种酶的双酶切都可以通过这个软件查询能不能做,做得时候用什么Buffer。
天行健
4楼2014-06-10 17:45:09
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蓝色泡沫321

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-06-10 17:45:09
反应时间倒是不会影响太多

buffer的话,这个第一次听说不共用,一般用Takara的酶,有张表,总是可以配上的。如果实在配不上,你用green buffer,这个是个万能buffer

其实,你不妨试一下用其中一个buffer,毕竟 ...

我用的两个酶都是thermo的,其中一个是Stu1,是个快酶,它本来的buffer就是10×FastDigest green buffer,另外一个就是EcoRⅠ,那我可以直接StuⅠ的buffer酶切是吗,buffer加的体积和单酶切加的量能一样吗
5楼2014-06-10 19:34:56
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youlinglyw

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一匡天下

优秀版主

引用回帖:
5楼: Originally posted by 蓝色泡沫321 at 2014-06-10 19:34:56
我用的两个酶都是thermo的,其中一个是Stu1,是个快酶,它本来的buffer就是10×FastDigest green buffer,另外一个就是EcoRⅠ,那我可以直接StuⅠ的buffer酶切是吗,buffer加的体积和单酶切加的量能一样吗...

感觉没问题,但是不敢保证。你做下看效果。
缓冲液按比例加就可以了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
天行健
6楼2014-06-10 19:41:00
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