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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 有关限制性内切酶的用法
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蓝色泡沫321

银虫 (初入文坛)

[求助] 有关限制性内切酶的用法 已有2人参与

我构建了T载体和目的基因的重组质粒，现在要进行双酶切获取目的基因，可是上下游用的酶速度不用，说明书上说一个只需要37度5min，另一个要37度16小时，而且两种酶的buffer也不一样，我要怎么建立酶切体系啊，两个酶和buffer是要一起加进去还是一个反应完在把另一个加进去
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1楼 2014-06-10 14:19:48
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
蓝色泡沫321(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-10 20:47:35
这种从载体上往下切最容易了，切完了跑个胶就一目了然了。如果你的酶质量好一点的话，在同一个体系里面切12 h是没啥问题的，可以先试试切过夜跑个胶回收。
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2楼2014-06-10 16:36:31
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蓝色泡沫321

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2014-06-10 16:36:31
这种从载体上往下切最容易了，切完了跑个胶就一目了然了。如果你的酶质量好一点的话，在同一个体系里面切12 h是没啥问题的，可以先试试切过夜跑个胶回收。

可是我的两个酶所用的buffer是不一样的，在网上也没有找到可以共用的buffer，难道只能先切一个再沉淀换buffer吗
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3楼2014-06-10 16:50:10
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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蓝色泡沫321(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-10 20:47:45
反应时间倒是不会影响太多

buffer的话，这个第一次听说不共用，一般用Takara的酶，有张表，总是可以配上的。如果实在配不上，你用green buffer，这个是个万能buffer

其实，你不妨试一下用其中一个buffer，毕竟酶切没那么多严格限制，选择buffer时，选用两种酶相对来说活性都很高的那一种就可以了，只不过是效率问题，效率低的话，多切会儿

另外，分步切也可以，不过效率没想象的高

另外，额外说一下，NEB的在线分析软件Double Digest Finder 不错。你想进行任意两种酶的双酶切都可以通过这个软件查询能不能做，做得时候用什么Buffer。
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天行健
4楼2014-06-10 17:45:09
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蓝色泡沫321

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-06-10 17:45:09
反应时间倒是不会影响太多

buffer的话，这个第一次听说不共用，一般用Takara的酶，有张表，总是可以配上的。如果实在配不上，你用green buffer，这个是个万能buffer

其实，你不妨试一下用其中一个buffer，毕竟 ...

我用的两个酶都是thermo的，其中一个是Stu1，是个快酶，它本来的buffer就是10×FastDigest green buffer，另外一个就是EcoRⅠ，那我可以直接StuⅠ的buffer酶切是吗，buffer加的体积和单酶切加的量能一样吗
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5楼2014-06-10 19:34:56
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主
引用回帖:
5楼: Originally posted by 蓝色泡沫321 at 2014-06-10 19:34:56
我用的两个酶都是thermo的，其中一个是Stu1，是个快酶，它本来的buffer就是10×FastDigest green buffer，另外一个就是EcoRⅠ，那我可以直接StuⅠ的buffer酶切是吗，buffer加的体积和单酶切加的量能一样吗...

感觉没问题，但是不敢保证。你做下看效果。
缓冲液按比例加就可以了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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天行健
6楼2014-06-10 19:41:00
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