应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 熔解曲线单峰，但电泳却发现除目的条带外的非特异扩增带（亦非引物二聚体）
51/1返回列表
查看: 1387  |  回复: 3
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

memesasa

新虫 (初入文坛)

[求助] 熔解曲线单峰，但电泳却发现除目的条带外的非特异扩增带（亦非引物二聚体） 已有1人参与

骨髓瘤细胞系，目的基因MDM4-FL
反应体系：
正反引物各0.65 ul（浓度为0.3uM）
模板cDNA 7.6ul（TAKARA PrimeScript   RT reagent Kit反转后，-10×稀释 ）
PCR MIX   12.4ul（ROCHE FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)）

反应程序：
预变性 95度    10min
变性     95度    10s
退火/延伸   58度  20s，40 cycles

熔解曲线为单峰，但电泳却能发现极少的非特异扩增条带（约500-700bp左右）。刚开始，我使用的退火温度为56度，该条带明显。58度仍然可见很少量的非特异条带。60度反而更明显（图3），最后将退火温度提高到62度，仍然存在。但不管什么温度，溶解曲线都是类似（图1）的单峰。此后，通过减少循环（从40降至35，）才基本消失（图2）。
marker从下往上，依次为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500。
12%聚丙烯凝胶电泳。第3张电泳上样量分5ul、10ul。第2张电泳上样量5ul。第一张熔解曲线与第二张图是同一次扩增，
请问：
这样的熔解曲线能认定为单峰吗？
为何熔解曲线和电泳结果不一致呢？不是说熔解曲线更为敏感吗？
第4张图，提高退火温度（其他都没有变）后，为何非特异条带反而更浓？谢谢

熔解曲线单峰，但电泳却发现除目的条带外的非特异扩增带（亦非引物二聚体）
MDM4-FL 熔解.png


熔解曲线单峰，但电泳却发现除目的条带外的非特异扩增带（亦非引物二聚体）-1
电泳.jpg





熔解曲线单峰，但电泳却发现除目的条带外的非特异扩增带（亦非引物二聚体）-2
10-5 MDM4-FL 56 58 60原图.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-10-07 16:02:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

memesasa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xfflying1 at 2014-10-08 15:48:34
这个现象确实存在，具体原因不是很清楚，问了一些有经验的也不知道，可能的原因是由于扩增后期片段浓度过高，变性退火过程会发生偏差，单链跟单链或者引物的交错配对。溶解曲线是单峰就没什么问题的。如果真的需要找 ...

回收测序是需要切胶回收、构建质粒才行把。没做过啊
赞一下 回复此楼
4楼2014-10-09 12:53:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 4 个回答

xfflying1

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个现象确实存在，具体原因不是很清楚，问了一些有经验的也不知道，可能的原因是由于扩增后期片段浓度过高，变性退火过程会发生偏差，单链跟单链或者引物的交错配对。溶解曲线是单峰就没什么问题的。如果真的需要找具体的原因可以将扩增产物回收测序，不过我们以前遇到这种情况也没有深究。
赞一下 回复此楼
2楼2014-10-08 15:48:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

memesasa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xfflying1 at 2014-10-08 15:48:34
这个现象确实存在，具体原因不是很清楚，问了一些有经验的也不知道，可能的原因是由于扩增后期片段浓度过高，变性退火过程会发生偏差，单链跟单链或者引物的交错配对。溶解曲线是单峰就没什么问题的。如果真的需要找 ...

谢谢你的热心回答，我主要感觉奇怪的是熔解曲线单峰，但电泳却有非目的片段。问技术支持也回答不上来
赞一下 回复此楼
3楼2014-10-08 16:22:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 4 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +21 不知道叫什么！ 2026-03-15 23/1150 2026-03-22 00:12 by BruceLiu320
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +5 生物工程调剂 2026-03-17 9/450 2026-03-21 23:32 by zhujy1982
[考研] 297求调剂 +11 戏精丹丹丹 2026-03-17 12/600 2026-03-21 17:47 by ColorlessPI
[考研] 296求调剂 +4 www_q 2026-03-20 4/200 2026-03-21 17:26 by 学员8dgXkO
[考研] 336求调剂 +5 rmc8866 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:24 by 学员8dgXkO
[考研] 一志愿武理材料305分求调剂 +6 想上岸的鲤鱼 2026-03-18 7/350 2026-03-21 01:03 by JourneyLucky
[考研] 323求调剂 +3 洼小桶 2026-03-18 3/150 2026-03-20 22:54 by JourneyLucky
[考研] 药学383 求调剂 +3 药学chy 2026-03-15 5/250 2026-03-20 22:11 by 云游重阳
[考研] 290求调剂 +7 ^O^乜 2026-03-19 7/350 2026-03-20 21:43 by JourneyLucky
[考研] 北科281学硕材料求调剂 +5 tcxiaoxx 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:35 by laoshidan
[考研] 一志愿武理材料工程348求调剂 +3 ￣^￣゜汗 2026-03-19 4/200 2026-03-20 21:01 by zhukairuo
[考研] 353求调剂 +3 拉钩不许变 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:56 by JourneyLucky
[考研] 一志愿南理工085701环境302求调剂院校 +3 葵梓卫队 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:28 by zhukairuo
[考研] 求调剂 +3 暗涌afhb 2026-03-16 3/150 2026-03-20 00:28 by 河南大学校友
[考研] 081700化工学硕调剂 +3 【1】 2026-03-16 3/150 2026-03-19 23:40 by edmund7
[考研] 320求调剂0856 +3 不想起名字112 2026-03-19 3/150 2026-03-19 22:53 by 学员8dgXkO
[考研] 085600材料与化工求调剂 +6 绪幸与子 2026-03-17 6/300 2026-03-19 13:27 by houyaoxu
[考博] 26申博 +4 八6八68 2026-03-16 4/200 2026-03-17 13:00 by 轻松不少随
[考研] 275求调剂 +4 太阳花天天开心 2026-03-16 4/200 2026-03-17 10:53 by 功夫疯狂
[考研] 中科院材料273求调剂 +4 yzydy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 15:59 by Gaodh_82
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭