| 查看: 1319 | 回复: 3 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
熔解曲线单峰，但电泳却发现除目的条带外的非特异扩增带（亦非引物二聚体）已有1人参与
|
||
|
骨髓瘤细胞系，目的基因MDM4-FL 反应体系： 正反引物各0.65 ul（浓度为0.3uM） 模板cDNA 7.6ul（TAKARA PrimeScript RT reagent Kit反转后，-10×稀释 ） PCR MIX 12.4ul（ROCHE FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)） 反应程序： 预变性 95度 10min 变性 95度 10s 退火/延伸 58度 20s，40 cycles 熔解曲线为单峰，但电泳却能发现极少的非特异扩增条带（约500-700bp左右）。刚开始，我使用的退火温度为56度，该条带明显。58度仍然可见很少量的非特异条带。60度反而更明显（图3），最后将退火温度提高到62度，仍然存在。但不管什么温度，溶解曲线都是类似（图1）的单峰。此后，通过减少循环（从40降至35，）才基本消失（图2）。 marker从下往上，依次为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500。 12%聚丙烯凝胶电泳。第3张电泳上样量分5ul、10ul。第2张电泳上样量5ul。第一张熔解曲线与第二张图是同一次扩增， 请问： 这样的熔解曲线能认定为单峰吗？ 为何熔解曲线和电泳结果不一致呢？不是说熔解曲线更为敏感吗？ 第4张图，提高退火温度（其他都没有变）后，为何非特异条带反而更浓？谢谢  MDM4-FL 熔解.png  电泳.jpg  10-5 MDM4-FL 56 58 60原图.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有101人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗？
已经有13人回复- 怎么判断非特异性扩增
已经有9人回复
- 定量PCR实验中关于标曲和溶解曲线的问题
已经有12人回复
- 荧光pcr阴性对照有扩增
已经有12人回复
- QPCR之 扩增效率
已经有8人回复
- QPCR 溶解曲线
已经有9人回复
- 荧光定量熔解温度
已经有16人回复
- 定量PCR读取荧光值的步骤需要保持多长时间？
已经有12人回复
4楼2014-10-09 12:53:18
2楼2014-10-08 15:48:34
3楼2014-10-08 16:22:43