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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 熔解曲线单峰，但电泳却发现除目的条带外的非特异扩增带（亦非引物二聚体）
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memesasa

新虫 (初入文坛)

[求助] 熔解曲线单峰，但电泳却发现除目的条带外的非特异扩增带（亦非引物二聚体） 已有1人参与

骨髓瘤细胞系，目的基因MDM4-FL
反应体系：
正反引物各0.65 ul（浓度为0.3uM）
模板cDNA 7.6ul（TAKARA PrimeScript   RT reagent Kit反转后，-10×稀释 ）
PCR MIX   12.4ul（ROCHE FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)）

反应程序：
预变性 95度    10min
变性     95度    10s
退火/延伸   58度  20s，40 cycles

熔解曲线为单峰，但电泳却能发现极少的非特异扩增条带（约500-700bp左右）。刚开始，我使用的退火温度为56度，该条带明显。58度仍然可见很少量的非特异条带。60度反而更明显（图3），最后将退火温度提高到62度，仍然存在。但不管什么温度，溶解曲线都是类似（图1）的单峰。此后，通过减少循环（从40降至35，）才基本消失（图2）。
marker从下往上，依次为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500。
12%聚丙烯凝胶电泳。第3张电泳上样量分5ul、10ul。第2张电泳上样量5ul。第一张熔解曲线与第二张图是同一次扩增，
请问：
这样的熔解曲线能认定为单峰吗？
为何熔解曲线和电泳结果不一致呢？不是说熔解曲线更为敏感吗？
第4张图，提高退火温度（其他都没有变）后，为何非特异条带反而更浓？谢谢

熔解曲线单峰，但电泳却发现除目的条带外的非特异扩增带（亦非引物二聚体）
MDM4-FL 熔解.png


熔解曲线单峰，但电泳却发现除目的条带外的非特异扩增带（亦非引物二聚体）-1
电泳.jpg





熔解曲线单峰，但电泳却发现除目的条带外的非特异扩增带（亦非引物二聚体）-2
10-5 MDM4-FL 56 58 60原图.jpg
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1楼 2014-10-07 16:02:29
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xfflying1

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个现象确实存在，具体原因不是很清楚，问了一些有经验的也不知道，可能的原因是由于扩增后期片段浓度过高，变性退火过程会发生偏差，单链跟单链或者引物的交错配对。溶解曲线是单峰就没什么问题的。如果真的需要找具体的原因可以将扩增产物回收测序，不过我们以前遇到这种情况也没有深究。
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2楼2014-10-08 15:48:34
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memesasa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xfflying1 at 2014-10-08 15:48:34
这个现象确实存在，具体原因不是很清楚，问了一些有经验的也不知道，可能的原因是由于扩增后期片段浓度过高，变性退火过程会发生偏差，单链跟单链或者引物的交错配对。溶解曲线是单峰就没什么问题的。如果真的需要找 ...

谢谢你的热心回答，我主要感觉奇怪的是熔解曲线单峰，但电泳却有非目的片段。问技术支持也回答不上来
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3楼2014-10-08 16:22:43
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memesasa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xfflying1 at 2014-10-08 15:48:34
这个现象确实存在，具体原因不是很清楚，问了一些有经验的也不知道，可能的原因是由于扩增后期片段浓度过高，变性退火过程会发生偏差，单链跟单链或者引物的交错配对。溶解曲线是单峰就没什么问题的。如果真的需要找 ...

回收测序是需要切胶回收、构建质粒才行把。没做过啊
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4楼2014-10-09 12:53:18
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