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熔解曲线单峰，但电泳却发现除目的条带外的非特异扩增带（亦非引物二聚体）已有1人参与
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骨髓瘤细胞系，目的基因MDM4-FL 反应体系： 正反引物各0.65 ul（浓度为0.3uM） 模板cDNA 7.6ul（TAKARA PrimeScript RT reagent Kit反转后，-10×稀释 ） PCR MIX 12.4ul（ROCHE FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)） 反应程序： 预变性 95度 10min 变性 95度 10s 退火/延伸 58度 20s，40 cycles 熔解曲线为单峰，但电泳却能发现极少的非特异扩增条带（约500-700bp左右）。刚开始，我使用的退火温度为56度，该条带明显。58度仍然可见很少量的非特异条带。60度反而更明显（图3），最后将退火温度提高到62度，仍然存在。但不管什么温度，溶解曲线都是类似（图1）的单峰。此后，通过减少循环（从40降至35，）才基本消失（图2）。 marker从下往上，依次为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500。 12%聚丙烯凝胶电泳。第3张电泳上样量分5ul、10ul。第2张电泳上样量5ul。第一张熔解曲线与第二张图是同一次扩增， 请问： 这样的熔解曲线能认定为单峰吗？ 为何熔解曲线和电泳结果不一致呢？不是说熔解曲线更为敏感吗？ 第4张图，提高退火温度（其他都没有变）后，为何非特异条带反而更浓？谢谢  MDM4-FL 熔解.png  电泳.jpg  10-5 MDM4-FL 56 58 60原图.jpg |
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