| 查看: 2111 | 回复: 10 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
luowen2012银虫 (初入文坛)
|
[求助]
苏云金芽孢杆菌晶体蛋白SDS-PAGE电泳条带不全，模糊不清，急死了 已有1人参与
|
|
|
做的是苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的蛋白分析，用的是12%的分离胶和5%的浓缩胶，8%的分离胶也试过了，可是电泳条带还是模糊，而且分离胶上端没有条带，只有靠下面才有条带，脱色效果也，不好不知道哪里出了问题。我的目标蛋白主要是130kD6和65kD的，电泳条件是浓缩胶85V,100mA，分离胶是120V，100mA，电泳时间共4个多小时，用的是北京六一的电泳槽。小弟才开始做电泳不久，麻烦哪位大神帮忙指点一下究竟问题出在哪里啊？不甚感激 1.5 mol/L分离胶缓冲液(pH 8.8)：18.15 g Tris，用1 mol/L HCl调节pH至8.8，加水至100 mL，4 ˚C保存。 0.5 mol/L浓缩胶缓冲液(pH 6.8)：6 g Tris，用1 mol/L HCl调节pH至6.8，加水至100 mL，4 ˚C保存。  溴酚蓝条带前沿为什么会有有一条粉红色的细线  IMG_2524.JPG  IMG_2526.JPG |
回复此楼» 猜你喜欢
327求调剂
已经有28人回复
-
一志愿中科大材料与化工，353分还有调剂学校吗
已经有6人回复
-
0854求调剂
已经有17人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急
已经有3人回复
-
药学求调剂
已经有15人回复
-
初试324 中药学 一志愿天中医 求调剂
已经有4人回复
-
279学硕食品专业求调剂院校
已经有29人回复
-
294求调剂
已经有10人回复
-
恳请有学校收留
已经有6人回复
-
求调剂推荐
已经有8人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- SDS-PAGE后，考染有条带，WB后检测不到目的蛋白。
已经有7人回复
- 跑SDS-PAGE时 maker条带还不错可是蛋白条带特别浅 求指点
已经有19人回复
- sds-page 凝胶电泳求助 只有marker条带是清晰的，但宽窄不一
已经有18人回复
- 绿色荧光蛋白SDS-PAGE电泳条带分析
已经有5人回复
- SDS-PAGE中蛋白条带位置不一致
已经有13人回复
- SDS-page 原核表达蛋白 电泳条带弥散
已经有6人回复
- SDS-PAGE还原与非还原电泳条带一样能说明该蛋白只有一个亚基吗
已经有6人回复
- SDS-PAGE 电泳时蛋白样品下不去什么原因？
已经有7人回复
- 求助，SDS-PAGE电泳图（Marker最后一个条带跑不出，胶底部很奇怪）
已经有11人回复
- SDS-PAGE蛋白电泳同一蛋白不同loading buffer条带不一样
已经有7人回复
- SDS-PAGE电泳看不到条带是什么原因？
已经有6人回复
- SDS-PAGE蛋白电泳条带问题
已经有7人回复
- 【求助/交流】SDS-PAGE蛋白电泳 样品中盐浓度和pH值对条带有影响？
已经有13人回复
- 【求助/交流】SDS-PAGE蛋白电泳的蛋白条带回收
已经有8人回复
hwd6218554
金虫 (著名写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 34.2
- 散金: 806
- 红花: 19
- 帖子: 1998
- 在线: 848.3小时
- 虫号: 396301
- 注册: 2007-06-08
- 性别: GG
- 专业: 功能陶瓷
【答案】应助回帖
★ ★ ★
luowen2012: 金币+3, ★有帮助, 谢谢了 2014-10-05 22:24:35
luowen2012: 金币+3, ★有帮助, 谢谢了 2014-10-05 22:24:35
|
电压调到最大，15mA跑浓缩胶，30mA跑分离胶至溴酚蓝至下边缘。革兰氏阳性菌本身不好裂解的，你只用一步loading buffer煮效果不会太好，要进行前期制备处理，具体请参考相关文献，制备好后用丙酮洗一下蛋白，再溶到1xLoading buffer中煮沸，离心上样。 |
luowen20127楼2014-10-05 22:01:36
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
luowen2012: 金币+3, ★有帮助, 感谢你给我的建议 2014-10-05 16:16:24
感谢参与，应助指数 +1
luowen2012: 金币+3, ★有帮助, 感谢你给我的建议 2014-10-05 16:16:24
|
你用的是全细胞跑电泳吧，浓度还是太高，可以试试6%，在胶顶部有聚集，分子量大的蛋白没有进入胶带。 还有整个胶有贯穿的拖尾，说明核酸含量太高，建议样品在沸水中5分钟后，离心，然后取上清跑电泳。 长假加班，不容易啊！ |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
2楼2014-10-05 13:44:16
hwd6218554
金虫 (著名写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 34.2
- 散金: 806
- 红花: 19
- 帖子: 1998
- 在线: 848.3小时
- 虫号: 396301
- 注册: 2007-06-08
- 性别: GG
- 专业: 功能陶瓷
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
luowen2012: 金币+3, ★有帮助, 非常感谢你的建议和帮助，对我有帮助，听君一席话胜查很多资料 2014-10-05 16:44:18
感谢参与，应助指数 +1
luowen2012: 金币+3, ★有帮助, 非常感谢你的建议和帮助，对我有帮助，听君一席话胜查很多资料 2014-10-05 16:44:18
| 不知道你是不是从苏云金芽孢杆菌提取的全蛋白，如果是提取的话，看电泳图就是没有裂解好，苏云金芽孢杆菌本身是革兰氏阳性菌细胞壁很厚很难裂解，需要强裂解剂或者溶菌酶。再一个marker怎么也跑的不是很好，电泳时间4个小时太长了，蛋白容易弥散的，再一个你上样孔的地方感觉有样品没进胶，你看一下你的Loading buffer，有没有问题，或者你加的loading buffer够不够，稍微多加点也没关系。 |
3楼2014-10-05 14:25:36
luowen2012
银虫 (初入文坛)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 131.8
- 散金: 150
- 帖子: 40
- 在线: 87.4小时
- 虫号: 2131823
- 注册: 2012-11-17
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
4楼2014-10-05 16:22:10
20