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luowen2012银虫 (初入文坛)
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苏云金芽孢杆菌晶体蛋白SDS-PAGE电泳条带不全，模糊不清，急死了 已有1人参与
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做的是苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的蛋白分析，用的是12%的分离胶和5%的浓缩胶，8%的分离胶也试过了，可是电泳条带还是模糊，而且分离胶上端没有条带，只有靠下面才有条带，脱色效果也，不好不知道哪里出了问题。我的目标蛋白主要是130kD6和65kD的，电泳条件是浓缩胶85V,100mA，分离胶是120V，100mA，电泳时间共4个多小时，用的是北京六一的电泳槽。小弟才开始做电泳不久，麻烦哪位大神帮忙指点一下究竟问题出在哪里啊？不甚感激 1.5 mol/L分离胶缓冲液(pH 8.8)：18.15 g Tris，用1 mol/L HCl调节pH至8.8，加水至100 mL，4 ˚C保存。 0.5 mol/L浓缩胶缓冲液(pH 6.8)：6 g Tris，用1 mol/L HCl调节pH至6.8，加水至100 mL，4 ˚C保存。  溴酚蓝条带前沿为什么会有有一条粉红色的细线  IMG_2524.JPG  IMG_2526.JPG |
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你用的是全细胞跑电泳吧，浓度还是太高，可以试试6%，在胶顶部有聚集，分子量大的蛋白没有进入胶带。 还有整个胶有贯穿的拖尾，说明核酸含量太高，建议样品在沸水中5分钟后，离心，然后取上清跑电泳。 长假加班，不容易啊！ |
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luowen20122楼2014-10-05 13:44:16
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| 不知道你是不是从苏云金芽孢杆菌提取的全蛋白，如果是提取的话，看电泳图就是没有裂解好，苏云金芽孢杆菌本身是革兰氏阳性菌细胞壁很厚很难裂解，需要强裂解剂或者溶菌酶。再一个marker怎么也跑的不是很好，电泳时间4个小时太长了，蛋白容易弥散的，再一个你上样孔的地方感觉有样品没进胶，你看一下你的Loading buffer，有没有问题，或者你加的loading buffer够不够，稍微多加点也没关系。 |
3楼2014-10-05 14:25:36
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电压调到最大，15mA跑浓缩胶，30mA跑分离胶至溴酚蓝至下边缘。革兰氏阳性菌本身不好裂解的，你只用一步loading buffer煮效果不会太好，要进行前期制备处理，具体请参考相关文献，制备好后用丙酮洗一下蛋白，再溶到1xLoading buffer中煮沸，离心上样。 |
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