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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 细胞最近总是染菌，帮忙分析一下什么原因？
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我听五月天

木虫 (正式写手)

[求助] 细胞最近总是染菌，帮忙分析一下什么原因？

最近染菌的情况都一样，培基不变臭，只变黄。高倍数下，细胞焦平面能看到小白线高速转动、游动，培基很浑浊的时候小白线是抱团的。
最近的变量
1、干粉配置的培基换成了塑料瓶现成培基，烧瓶口不敢很猛了。
2、以前给药后，96孔板都一般都正常，最近有时有几个孔染菌，有时候整个板子染菌。
3、每次染菌都是一瓶培基用过几次之后，快用完时最明显。刚加好血清用几次都没出现问题。
4、貌似一年多没给超净台换高效滤膜了。
5、复苏细胞第一天好的，换液后，第二天就染菌。
怀疑
1、培基质量问题。cyagen的液体培养基。----估计培基有问题可能不大
2、操作问题。但是绝对没有手在瓶口上经过的类似低级错误。
3、超净台需要换膜？
4、细胞室太脏需要熏蒸？
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为爱而生
1楼2014-09-17 09:30:22
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风信子寻梦

木虫 (职业作家)
培养细胞注意的事项太多，不过只要操作熟练注意关键的介个步骤应该不会出现问题。
1、灭菌物品一定要灭菌彻底，你注意一下你使用的器具，像移液管、枪头、配培养基用的玻璃瓶等等，确保无菌，灭好的器具如果长时间不用也是容易长菌的。
2、操作时一定要秉承只有是无菌的东西才能往超净台里拿的原则。
3、个人觉得养细胞不是件困难的事儿，唯一需要的就是细心!我建议你把所有需要的东西重新灭菌，培养基、血清、双抗什么的都用新的，操作时每一个步骤都注意一点，慢一点，在这个过程中你就可以发现问题出在哪里！
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2楼2014-09-17 16:53:47
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我听五月天

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 风信子寻梦 at 2014-09-17 16:53:47
培养细胞注意的事项太多，不过只要操作熟练注意关键的介个步骤应该不会出现问题。
1、灭菌物品一定要灭菌彻底，你注意一下你使用的器具，像移液管、枪头、配培养基用的玻璃瓶等等，确保无菌，灭好的器具如果长时间 ...

谢谢！最近一直很满了，蹑手蹑脚的，比上学期温柔的多，但做天操作的几瓶都染菌了，一下子泄气了。
还有个问题，我做两种药物混合给药的细胞体外毒性实验，上学期的结果一直重复不出来，怎么办？是不是传代造成的？后边还想做别的化合物还有机理，现在卡住了，文章没有还要找工作，很着急~~~
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为爱而生
3楼2014-09-17 21:50:46
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xipha

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
我听五月天: 金币+7, ★★★很有帮助 2014-09-18 07:37:14
1、干粉配置的培基换成了塑料瓶现成培基，烧瓶口不敢很猛了。
我觉得细胞房每个星期要清洗, 做实验要干净利落,但是还是不要用酒精灯烧了. 首先温度就不是很够,然后时间也完全不够. 只是增加污染的机会而已.

2、以前给药后，96孔板都一般都正常，最近有时有几个孔染菌，有时候整个板子染菌。
没染菌的孔有什么规律么?

3、每次染菌都是一瓶培基用过几次之后，快用完时最明显。刚加好血清用几次都没出现问题。
怀疑是操作带来的污染. 水浴, 超净台, 吸管.

4、貌似一年多没给超净台换高效滤膜了。
这个有可能.

5、复苏细胞第一天好的，换液后，第二天就染菌。
这个不说明什么, 第一天要是有细菌可能也还没长起来.

建议楼主找找附近实验室的人看看楼主的设施和看楼主做一遍细胞,看看是哪里出了问题.
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4楼2014-09-18 02:56:38
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我听五月天

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xipha at 2014-09-18 02:56:38
1、干粉配置的培基换成了塑料瓶现成培基，烧瓶口不敢很猛了。
我觉得细胞房每个星期要清洗, 做实验要干净利落,但是还是不要用酒精灯烧了. 首先温度就不是很够,然后时间也完全不够. 只是增加污染的机会而已.

2、 ...

非常感谢。前天操作完成后我把所剩不多的培养基从超净台拿出来一直放在常温，昨天发现细胞全部染菌，但是常温的培基没事，但是今天看培基都浑浊了。这！！！以前我的操作从来不会出现培基染菌啊！！！？？？培基染菌什么原因的概率最大？巴氏吸管不干净？烧瓶口（我看到过康宁视屏里操作是单手拧开瓶口电动移液器吸液马上盖上瓶口--因为我用小吸管小所以没试过）？您怎么看？？
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为爱而生
5楼2014-09-18 16:06:49
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风信子寻梦

木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 我听五月天 at 2014-09-17 21:50:46
谢谢！最近一直很满了，蹑手蹑脚的，比上学期温柔的多，但做天操作的几瓶都染菌了，一下子泄气了。
还有个问题，我做两种药物混合给药的细胞体外毒性实验，上学期的结果一直重复不出来，怎么办？是不是传代造成的 ...

做细胞实验重复实验结果，实验设计、实验步骤、实验条件等一般是可以严格一致的，但是有两个东西是很难控制的，那就是细胞的状态和化合物的稳定性。
1、细胞传的代数越多，变异的可能性越大，我自己就遇到过这样的问题，所以我们实验室的原则是，细胞传代到一定的代数就直接扔掉不要了。
2、化合物的稳定性对实验结果也有很大的影响，你重复不出实验结果也有可能是化合物的变化造成的。
你自己根据具体情况再找找原因吧！
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6楼2014-09-18 16:26:41
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xipha

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 我听五月天 at 2014-09-18 16:06:49
非常感谢。前天操作完成后我把所剩不多的培养基从超净台拿出来一直放在常温，昨天发现细胞全部染菌，但是常温的培基没事，但是今天看培基都浑浊了。这！！！以前我的操作从来不会出现培基染菌啊！！！？？？培基染 ...

一般细胞用耗材都是一次性, 或者灭过菌的器具. 出现污染很有可能是超净台,水浴锅,孵育箱染菌了. 以超净台,孵育箱最为常见. 操作染菌的可能还有一种就是你的袖子. 你可以用巴氏消毒液杀杀超净台,孵育箱 这个一般一个月一次清洁细胞房的时候一起处理, 孵育箱水盘和水浴锅也是每月洗一洗换水完往里面加一点抗生素, 或者有买专门供细胞房灭菌的喷剂和药剂来处理超净台,水浴锅,孵育箱.细胞用实验服建议专用,两到三周洗一次.
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7楼2014-09-19 02:11:26
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yoconbio

捐助贵宾 (初入文坛)

细胞培养基专家
引用回帖:
7楼: Originally posted by xipha at 2014-09-19 02:11:26
一般细胞用耗材都是一次性, 或者灭过菌的器具. 出现污染很有可能是超净台,水浴锅,孵育箱染菌了. 以超净台,孵育箱最为常见. 操作染菌的可能还有一种就是你的袖子. 你可以用巴氏消毒液杀杀超净台,孵育箱 这个一般一个 ...

学习了
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8楼2014-10-15 10:34:50
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