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wxy3937

金虫 (正式写手)

[交流] ELISA试验不显色,希望得到大家帮助 已有2人参与

1) 样品为鱼肝micorsome,100ul加入ELISA板,每个样品三次重复。
2) 湿盒中,4度冰箱过夜。
3) 200ul 低盐缓冲液洗涤,轻微晃动洗3次每次5分钟
4) 5%脱脂奶粉封闭1小时
5) 200ul 低盐缓冲液洗涤,轻微晃动洗3次每次5分钟
6) 100ul 一抗,室温1.5小时
7) 200ul高盐缓冲液洗涤,轻微晃动洗3次每次5分钟
8) 100ul 二抗,室温1.5小时
9) 200ul高盐缓冲液洗涤,轻微晃动洗3次每次5分钟
10) 100ul TMB/OPD显色 30分钟
11) 1N 硫酸终止反应
TMB和OPD都已经试过了,均不显色,我猜测我试验的问题是蛋白没有煮过。希望大家帮我一下,谢谢。
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wxy3937

金虫 (正式写手)

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4楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-01 18:55:34
同时好奇标准蛋白染出来没?

也没有。我没包被上吗,还是我洗的时候洗掉了?
5楼2014-09-01 20:11:46
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金虫 (正式写手)

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3楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-09-01 18:32:39
你先把试剂盒的说明书贴上来看看。

没有用试剂盒
6楼2014-09-01 20:13:02
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金虫 (正式写手)

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2楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-01 18:12:56
本科学渣表示一年前做的Elisa,现在忘得差不多了。有几个疑问,样本提取多少时间了?我前一天提取的样本同样没煮但第二天染出来了。另外样本是否-70度保存?是否因保存不善分解?Elisa盒子不是里边已经加了一抗吗? ...

样品已经有20天了,保存在-20度,关于降解这个问题,我前段时间做western blot 条带很好;室温达不到37度。你们现在都用试剂盒吗?我做得是鱼的Cytochrome P450,一抗是自己做的鼠抗鱼单抗,不知道有没有特异性抗体的试剂盒。
8楼2014-09-01 20:28:28
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金虫 (正式写手)

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7楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-01 19:20:48
标准蛋白没染出来,如果不是盒子有问题就是操作有问题。洗是洗不掉的,盒子有没有失效?我仔细找了,当时没拍下说明书的照片,我记得当时全程是在37℃摇床上进行的,一天搞定96孔板的,建议楼主找到说明书,严格按 ...

我的标准蛋白可能充其量算internal positive吧,不是买的公司的。
9楼2014-09-01 20:34:09
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wxy3937

金虫 (正式写手)

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7楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-01 19:20:48
标准蛋白没染出来,如果不是盒子有问题就是操作有问题。洗是洗不掉的,盒子有没有失效?我仔细找了,当时没拍下说明书的照片,我记得当时全程是在37℃摇床上进行的,一天搞定96孔板的,建议楼主找到说明书,严格按 ...

一抗二抗孵育也要在摇床吗,我放着没管,下次可能要注意了。
11楼2014-09-01 20:42:17
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金虫 (正式写手)

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10楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-01 19:35:31
怀疑是试剂盒和抗体的问题,经费充足的话你可以考虑订做。我当初做的是老师买来的,,好像一千左右,测了IL-1β和IL-6.
...

谢谢你。
12楼2014-09-01 20:45:06
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wxy3937

金虫 (正式写手)

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14楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-01 20:09:15
一抗和二抗就不必在摇床上孵育了吧。对楼主操作中的疑问,双抗体夹心法包埋的应该是一抗,可是楼主包埋的是样品,而且包埋方式存在未说明,包埋是否规范?如何包埋的?
...

间接法,样品+一抗+二抗,类似于WB
15楼2014-09-01 21:12:10
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wxy3937

金虫 (正式写手)

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17楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-01 20:36:33
另外楼主包埋的时直接把蛋白加进去,没有PH 9.6下的碳酸盐缓冲液,怎么包埋成功的?

蛋白是碳酸缓冲液稀释的
18楼2014-09-01 22:32:16
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wxy3937

金虫 (正式写手)

送红花一朵
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19楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-09-02 07:03:47
可能问题:
1. 你制单抗时是用的什么抗原制备的?如果是变性蛋白,那么你做ELISA的样品必须要煮,否则不显色。
2. 高盐缓冲液洗板可能影响显色,用通用的洗涤缓冲液PBST就可以了。
3. 应该用双抗夹心来检测你样 ...

我查了一下,介绍了什么是蛋白变性,但是还是不懂什么是变性蛋白,请您帮忙解释一下。
谢谢,按照你的建议试试煮过并换洗涤缓冲液。
22楼2014-09-02 08:57:53
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