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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » ELISA试验不显色，希望得到大家帮助
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wxy3937

金虫 (正式写手)

[交流] ELISA试验不显色，希望得到大家帮助 已有2人参与

1) 样品为鱼肝micorsome，100ul加入ELISA板，每个样品三次重复。
2) 湿盒中，4度冰箱过夜。
3) 200ul 低盐缓冲液洗涤，轻微晃动洗3次每次5分钟
4) 5%脱脂奶粉封闭1小时
5) 200ul 低盐缓冲液洗涤，轻微晃动洗3次每次5分钟
6) 100ul 一抗，室温1.5小时
7) 200ul高盐缓冲液洗涤，轻微晃动洗3次每次5分钟
8) 100ul 二抗，室温1.5小时
9) 200ul高盐缓冲液洗涤，轻微晃动洗3次每次5分钟
10) 100ul TMB/OPD显色 30分钟
11) 1N 硫酸终止反应
TMB和OPD都已经试过了，均不显色，我猜测我试验的问题是蛋白没有煮过。希望大家帮我一下，谢谢。
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1楼 2014-09-01 17:19:50
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张易120

木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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wxy3937: 金币+8, 谢谢你 2014-09-01 21:30:15
本科学渣表示一年前做的Elisa，现在忘得差不多了。有几个疑问，样本提取多少时间了？我前一天提取的样本同样没煮但第二天染出来了。另外样本是否-70度保存？是否因保存不善分解？Elisa盒子不是里边已经加了一抗吗？另外楼主的室温是37度吗？建议楼主严格按照盒子带的说明书操作。(希望楼主多多指教，勿喷)

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2楼2014-09-01 19:12:56
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
wxy3937: 金币+8, 谢谢你 2014-09-01 21:30:35
你先把试剂盒的说明书贴上来看看。
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3楼2014-09-01 19:32:39
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张易120

木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
同时好奇标准蛋白染出来没？

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4楼2014-09-01 19:55:34
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wxy3937

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-01 18:55:34
同时好奇标准蛋白染出来没？

也没有。我没包被上吗，还是我洗的时候洗掉了？
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5楼2014-09-01 20:11:46
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wxy3937

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-09-01 18:32:39
你先把试剂盒的说明书贴上来看看。

没有用试剂盒
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6楼2014-09-01 20:13:02
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张易120

木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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5楼: Originally posted by wxy3937 at 2014-09-01 20:11:46
也没有。我没包被上吗，还是我洗的时候洗掉了？...

标准蛋白没染出来，如果不是盒子有问题就是操作有问题。洗是洗不掉的，盒子有没有失效？我仔细找了，当时没拍下说明书的照片，我记得当时全程是在37℃摇床上进行的，一天搞定96孔板的，建议楼主找到说明书，严格按说明书操作

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7楼2014-09-01 20:20:48
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wxy3937

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-01 18:12:56
本科学渣表示一年前做的Elisa，现在忘得差不多了。有几个疑问，样本提取多少时间了？我前一天提取的样本同样没煮但第二天染出来了。另外样本是否-70度保存？是否因保存不善分解？Elisa盒子不是里边已经加了一抗吗？ ...

样品已经有20天了，保存在-20度，关于降解这个问题，我前段时间做western blot 条带很好；室温达不到37度。你们现在都用试剂盒吗？我做得是鱼的Cytochrome P450，一抗是自己做的鼠抗鱼单抗，不知道有没有特异性抗体的试剂盒。
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8楼2014-09-01 20:28:28
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wxy3937

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-01 19:20:48
标准蛋白没染出来，如果不是盒子有问题就是操作有问题。洗是洗不掉的，盒子有没有失效？我仔细找了，当时没拍下说明书的照片，我记得当时全程是在37℃摇床上进行的，一天搞定96孔板的，建议楼主找到说明书，严格按 ...

我的标准蛋白可能充其量算internal positive吧，不是买的公司的。
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9楼2014-09-01 20:34:09
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张易120

木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by wxy3937 at 2014-09-01 20:28:28
样品已经有20天了，保存在-20度，关于降解这个问题，我前段时间做western blot 条带很好；室温达不到37度。你们现在都用试剂盒吗？我做得是鱼的Cytochrome P450，一抗是自己做的鼠抗鱼单抗，不知道有没有特异性抗体 ...

怀疑是试剂盒和抗体的问题，经费充足的话你可以考虑订做。我当初做的是老师买来的,，好像一千左右，测了IL-1β和IL-6.

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10楼2014-09-01 20:35:31
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