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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » ELISA试验不显色，希望得到大家帮助
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wxy3937

金虫 (正式写手)

[交流] ELISA试验不显色，希望得到大家帮助 已有2人参与

1) 样品为鱼肝micorsome，100ul加入ELISA板，每个样品三次重复。
2) 湿盒中，4度冰箱过夜。
3) 200ul 低盐缓冲液洗涤，轻微晃动洗3次每次5分钟
4) 5%脱脂奶粉封闭1小时
5) 200ul 低盐缓冲液洗涤，轻微晃动洗3次每次5分钟
6) 100ul 一抗，室温1.5小时
7) 200ul高盐缓冲液洗涤，轻微晃动洗3次每次5分钟
8) 100ul 二抗，室温1.5小时
9) 200ul高盐缓冲液洗涤，轻微晃动洗3次每次5分钟
10) 100ul TMB/OPD显色 30分钟
11) 1N 硫酸终止反应
TMB和OPD都已经试过了，均不显色，我猜测我试验的问题是蛋白没有煮过。希望大家帮我一下，谢谢。
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1楼 2014-09-01 17:19:50
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wxy3937

金虫 (正式写手)
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19楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-09-02 07:03:47
可能问题：
1. 你制单抗时是用的什么抗原制备的？如果是变性蛋白，那么你做ELISA的样品必须要煮，否则不显色。
2. 高盐缓冲液洗板可能影响显色，用通用的洗涤缓冲液PBST就可以了。
3. 应该用双抗夹心来检测你样 ...

懂你的意思了，制备的时候是变性过的。谢谢
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23楼2014-09-02 10:28:55
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wxy3937

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-01 18:12:56
本科学渣表示一年前做的Elisa，现在忘得差不多了。有几个疑问，样本提取多少时间了？我前一天提取的样本同样没煮但第二天染出来了。另外样本是否-70度保存？是否因保存不善分解？Elisa盒子不是里边已经加了一抗吗？ ...

今天做了有结果，显色是用的OPD，但是有一点我不清楚，为什么颜色跟加入的样品浓度负相关？
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24楼2014-09-03 17:33:36
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wxy3937

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-09-01 18:32:39
你先把试剂盒的说明书贴上来看看。

今天做了有结果，显色是用的OPD，但是有一点我不清楚，为什么颜色跟加入的样品浓度负相关？
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25楼2014-09-03 17:33:48
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wxy3937

金虫 (正式写手)
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27楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-03 20:01:04
改变什么后染出来的，求教

1) 昨天4度冰箱包埋的，拿出来之后室温平衡了15分钟，之前的实验均未平衡
2) 加缓冲液洗涤的时候轻一点，猜测是不是缓冲液打的太快会冲掉一部分蛋白
3) 同时做了变性和未变性蛋白，未变性的效果好
还有一个问题不清楚，做了ＴＭＢ和ＯＰＤ，但是ＴＭＢ很快蓝绿色就褪去了，不是大概１５－３０分钟吗，是Ｈ２Ｏ２加多了吗？你们ＴＭＢ的配方是什么？
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28楼2014-09-03 21:58:44
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wxy3937

金虫 (正式写手)
引用回帖:
31楼: Originally posted by 张易120 at 2014-09-03 21:13:33
其实我做的盒子里A液和B 液都是现成的，不用自己配
...

请问你有没有做过酶活和酶抑制试验，方便的话教教我。
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32楼2014-09-03 22:46:07
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wxy3937

金虫 (正式写手)
引用回帖:
35楼: Originally posted by zq19881029 at 2014-09-04 14:18:37
你有没有先用碳酸盐缓冲液把蛋白包被在酶标板上啊？还有洗涤的时候貌似是不需要晃动的，静置放几分钟就可以了，一抗二抗的孵育应该在37度培养箱半个小时就足够了啊，TMB显色时间在10分钟以内。以上是我个人的小建议 ...

谢谢你。
我之前晃得幅度有点大，因为担心洗不干净
TMB确实在10分钟之内褪掉了
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36楼2014-09-04 16:00:42
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wxy3937

金虫 (正式写手)
引用回帖:
37楼: Originally posted by 留小保 at 2014-09-04 16:39:59
你最好看一下说明书，是在室温下1.5个小时吗，会不会是实验室温度低，最好还是在37度吧

嗯，谢谢。今天试试37度看
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39楼2014-09-10 13:11:55
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wxy3937

金虫 (正式写手)
引用回帖:
38楼: Originally posted by berniehuang at 2014-09-05 14:30:20
抗体不是可以用于任何实验的，是否能用于ELISA是需要摸索的。不知LZ在制备单抗的时候，是用什么方法验证抗体的，ELISA？免疫荧光？流式？……有没有做过与天然蛋白的反应？在抗体没有问题的情况，再考虑实验方案。

谢谢你的建议。
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40楼2014-09-10 13:12:37
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