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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 求见染色质-蛋白质同沉淀技术大神交流
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dqtianbin

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1楼2014-07-25 21:05:14
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

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★ ★ ★ ★
dqtianbin(kx444555代发): 金币+4, 鼓励交流 2014-07-28 08:41:39
引用回帖:
8楼: Originally posted by 蜂鸟404 at 2014-07-26 23:01:53
我有个问题想问一下，做共沉淀后，把结合染色质DNA的蛋白质用蛋白酶处理后，理论上剩下一些被超生打断的无数小片段，因为打断是随机的，所以会有很多噪音，当然这些序列会有重复，只有通过高通量测序将重复比对才能 ...

ChIP的主要用途是确定DNA结合蛋白（如转录因子等）是否与基因的某部位结合。以转录因子A举例说明：
转录因子A一定有许多受其调节的靶基因，假定你怀疑B基因可能是转录因子A的靶基因，那么你要回答的问题首先是A对B在转录水平上有直接调节作用；然后是回答A是否与B的调控区域（增强子/启动子区域）结合，只有结合了才会在转录水平上对B调节。作为转录因子，与靶基因相互作用一般都通过一段concensus顺序，即所谓的response elements实现的，所以在回答此问题之前，要对靶基因B的调控区进行分析，看有无转录因子A的可能结合顺序，一般可能不只一个，如果有这样的顺序，就更加支持B是A的靶基因的判断。接下来就要具体研究A与B调控区域的结合情况，此时就用的ChIP assay. 具体说，用A的抗体进行IP，然后用B调控区中含有A结合的response elements附近的上下游引物对沉淀物中的DNA进行PCR。如果有产物就证实A与B的调控区结合。当然需要有对照，对照可以采用距离response elements有一段距离的上下游引物进行扩增。理论上对照引物是不该有扩增产物的。到此为止，就把所要回答的问题回答了。当然，严格说来，实验还没有结束，还应该用B调控区域做一个reporter gene（包括respnse elements wild-type和mutants），然后用transient transfection观察转录因子A对B基因调控区所控制的报告基因表达的诱导情况，具体说，如果所用response elements是野生型，则该reporter会受A的调控，若是突变型，则不再手A的调控。至此，整个问题算是大致完整解决了。

除了主要上述应用之外，偶尔也可以用于寻找转录因子的靶基因。仍以上述转录因子A为例，为了寻找A的靶基因，可以用A的抗体做IP，然后将所获得的DNA片段进行克隆，并进行序列测定，最后按照A的concensus response elements进行分析所得到的诸多克隆是否含有A的结合位点而筛出A的可能靶基因（调控区）。这部分也许是你所理解的内容？
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9楼2014-07-28 03:19:11
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 22:28:34
gyesang: 回帖置顶 2014-07-25 22:28:36
dqtianbin: 金币+5, ★★★很有帮助, 我们实验室在做一个类似的摸索，他们觉得CHIP太贵了，所以在3C基础上做一个比较便宜的实验，好像也能达到目的，但是一年过了一直没有成功，于是有阴影了。如您说，这个PULL DOWN的抗体看来很重要，自己做的抗体应该不行吧，要是没有商品化的怎么办 2014-07-26 09:13:12
试剂盒不试剂盒都不是问题。如果你对IP熟悉就更不是问题了。ChIP assay就是一个IP实验，完了之后做PCR。本实验的关键不是IP本身，而是对DNA的超声处理。只要这一步做的好，其他完全取决于所用抗体的好坏了。由于在ChIP前细胞做了cross－link处理，所以在超声时和普通细胞是不同的，具体要自己好好摸索一下：自己超声仪器功率的设定、超声时间、时间间隔、超声次数等等，还有细胞cross－link的时间等等，这些都与超声效果有关系。二后者直接决定了你后续ChIP的结果。当然在买抗体时如果可能最好买ChIP级别的，或者他人有成功使用者的。
祝好运！
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2楼2014-07-25 22:11:38
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-26 17:00:44
自己做的抗体不一定就不行的，这个无法判断，只有做了才知道。
其实ChIP没有什么贵的，就是需要抗体。其他都是常规的东西。真的不需要试剂盒，无非几个缓冲液而已。再就是PCR，也无需要多少钱的。
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3楼2014-07-26 10:16:09
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dqtianbin

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4楼2014-07-26 11:29:37
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-26 19:26:45
引用回帖:
4楼: Originally posted by dqtianbin at 2014-07-25 22:29:37
如果外包呢，大概花费多少钱呢？您应该自己做过吧，在病毒与细胞之间的研究您有做过吗...

我们这里是常规实验之一。未曾外包过。
我们的对象注意是转录因子与靶基因之间的相互作用。
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5楼2014-07-26 11:33:29
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dqtianbin

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6楼2014-07-26 12:26:22
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至尊木虫 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dqtianbin: 金币+5, ★★★很有帮助, 恩，先谢过了，到做实验的时候定请教您 2014-07-26 13:38:51
引用回帖:
6楼: Originally posted by dqtianbin at 2014-07-25 23:26:22
敢问您在哪个实验室呢？挺牛啊。那看来您那边已经很成熟了，是否可以合作来您那儿学习啊...

只是一种方法而已，和牛无关。
有什么具体问题可以发给我，我则尽我所能。
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7楼2014-07-26 12:30:17
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蜂鸟404

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★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-07-28 08:41:32
引用回帖:
5楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-26 11:33:29
我们这里是常规实验之一。未曾外包过。
我们的对象注意是转录因子与靶基因之间的相互作用。...

我有个问题想问一下，做共沉淀后，把结合染色质DNA的蛋白质用蛋白酶处理后，理论上剩下一些被超生打断的无数小片段，因为打断是随机的，所以会有很多噪音，当然这些序列会有重复，只有通过高通量测序将重复比对才能确定具体的结合序列，不过这样太麻烦，用pcr怎么确定

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8楼2014-07-27 12:01:53
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蜂鸟404

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引用回帖:
9楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-28 03:19:11
ChIP的主要用途是确定DNA结合蛋白（如转录因子等）是否与基因的某部位结合。以转录因子A举例说明：
转录因子A一定有许多受其调节的靶基因，假定你怀疑B基因可能是转录因子A的靶基因，那么你要回答的问题首先是A对 ...

多谢大神回答，受益匪浅，确实如你所言，我现在确定要研究一个转录因子（细菌中的，可能调控了一些毒力基因），现在想找它所直接调控的基因，于是我想到了共沉淀然后高通量测序，可是后来因为抗体效果不好，背景太高，失败了，我想问一下，像我这种情况，不是用来验证而是去寻找下游直接调控基因的，有没有什么更有效的方法

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10楼2014-07-28 13:23:03
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