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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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dqtianbin

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dqtianbin(kx444555代发): 金币+4, 鼓励交流 2014-07-28 08:41:39
引用回帖:
8楼: Originally posted by 蜂鸟404 at 2014-07-26 23:01:53
我有个问题想问一下,做共沉淀后,把结合染色质DNA的蛋白质用蛋白酶处理后,理论上剩下一些被超生打断的无数小片段,因为打断是随机的,所以会有很多噪音,当然这些序列会有重复,只有通过高通量测序将重复比对才能 ...

ChIP的主要用途是确定DNA结合蛋白(如转录因子等)是否与基因的某部位结合。以转录因子A举例说明:
转录因子A一定有许多受其调节的靶基因,假定你怀疑B基因可能是转录因子A的靶基因,那么你要回答的问题首先是A对B在转录水平上有直接调节作用;然后是回答A是否与B的调控区域(增强子/启动子区域)结合,只有结合了才会在转录水平上对B调节。作为转录因子,与靶基因相互作用一般都通过一段concensus顺序,即所谓的response elements实现的,所以在回答此问题之前,要对靶基因B的调控区进行分析,看有无转录因子A的可能结合顺序,一般可能不只一个,如果有这样的顺序,就更加支持B是A的靶基因的判断。接下来就要具体研究A与B调控区域的结合情况,此时就用的ChIP assay. 具体说,用A的抗体进行IP,然后用B调控区中含有A结合的response elements附近的上下游引物对沉淀物中的DNA进行PCR。如果有产物就证实A与B的调控区结合。当然需要有对照,对照可以采用距离response elements有一段距离的上下游引物进行扩增。理论上对照引物是不该有扩增产物的。到此为止,就把所要回答的问题回答了。当然,严格说来,实验还没有结束,还应该用B调控区域做一个reporter gene(包括respnse elements wild-type和mutants),然后用transient transfection观察转录因子A对B基因调控区所控制的报告基因表达的诱导情况,具体说,如果所用response elements是野生型,则该reporter会受A的调控,若是突变型,则不再手A的调控。至此,整个问题算是大致完整解决了。

除了主要上述应用之外,偶尔也可以用于寻找转录因子的靶基因。仍以上述转录因子A为例,为了寻找A的靶基因,可以用A的抗体做IP,然后将所获得的DNA片段进行克隆,并进行序列测定,最后按照A的concensus response elements进行分析所得到的诸多克隆是否含有A的结合位点而筛出A的可能靶基因(调控区)。这部分也许是你所理解的内容?
9楼2014-07-28 03:19:11
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gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流! 2014-07-25 22:28:34
gyesang: 回帖置顶 2014-07-25 22:28:36
dqtianbin: 金币+5, ★★★很有帮助, 我们实验室在做一个类似的摸索,他们觉得CHIP太贵了,所以在3C基础上做一个比较便宜的实验,好像也能达到目的,但是一年过了一直没有成功,于是有阴影了。如您说,这个PULL DOWN的抗体看来很重要,自己做的抗体应该不行吧,要是没有商品化的怎么办 2014-07-26 09:13:12
试剂盒不试剂盒都不是问题。如果你对IP熟悉就更不是问题了。ChIP assay就是一个IP实验,完了之后做PCR。本实验的关键不是IP本身,而是对DNA的超声处理。只要这一步做的好,其他完全取决于所用抗体的好坏了。由于在ChIP前细胞做了cross-link处理,所以在超声时和普通细胞是不同的,具体要自己好好摸索一下:自己超声仪器功率的设定、超声时间、时间间隔、超声次数等等,还有细胞cross-link的时间等等,这些都与超声效果有关系。二后者直接决定了你后续ChIP的结果。当然在买抗体时如果可能最好买ChIP级别的,或者他人有成功使用者的。
祝好运!
2楼2014-07-25 22:11:38
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-26 17:00:44
自己做的抗体不一定就不行的,这个无法判断,只有做了才知道。
其实ChIP没有什么贵的,就是需要抗体。其他都是常规的东西。真的不需要试剂盒,无非几个缓冲液而已。再就是PCR,也无需要多少钱的。
3楼2014-07-26 10:16:09
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4楼2014-07-26 11:29:37
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