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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 免疫共沉淀实验抗体的选择
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)

[求助] 免疫共沉淀实验抗体的选择 已有2人参与

小弟是新手，刚开始做实验，向诸位请教一个问题。我要做一个蛋白的 IP,520个AA，58/55kDa，查文献都是用标签FLAG的抗体做的，但现在没有这个标签的真核表达载体，想直接转染后用目的蛋白的抗体做，不知道可不可以？还有就是，什么时候用标签，什么时候可以不用？标签的选择有没有要求？请大家不吝指教，**！ps：小弟新虫，金币不多，大家见谅啊！
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免疫共沉淀

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1楼 2014-07-17 14:51:26
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然用目的蛋白的抗体做IP，还要用标签干什么？
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2楼2014-07-17 17:01:27
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-17 17:01:27
既然用目的蛋白的抗体做IP，还要用标签干什么？

看的文献上都是用含标签的目的蛋白基因的载体转染细胞，然后做IP，我想，是不是目的蛋白的抗体不适合做IP，所以转染时需要加个标签，以便用标签蛋白抗体将目的蛋白沉淀下来？如果能直接用目的蛋白的抗体，那正是我所期望的，试验简单啊，，，
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3楼2014-07-17 19:28:14
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做Co－IP时是否选用Tag的抗体不是主要的，重要的是你用的抗体是否可以做IP以及IP的效果如何。所以说，如果你目标蛋白的抗体可以用于IP，且效果好，就不需要顾及Tag的问题。单就Co-IP或IP而言，goat抗体最好，mouse次之，rabbit不是太好，这里好坏的重要标准之一是Western blot时重轻链信号的干扰问题.........
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4楼2014-07-17 22:21:05
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 镜子的诱惑 at 2014-07-17 19:28:14
看的文献上都是用含标签的目的蛋白基因的载体转染细胞，然后做IP，我想，是不是目的蛋白的抗体不适合做IP，所以转染时需要加个标签，以便用标签蛋白抗体将目的蛋白沉淀下来？如果能直接用目的蛋白的抗体，那正是我 ...

抗体能用就不需要标签
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5楼2014-07-18 08:46:49
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-17 22:21:05
做Co－IP时是否选用Tag的抗体不是主要的，重要的是你用的抗体是否可以做IP以及IP的效果如何。所以说，如果你目标蛋白的抗体可以用于IP，且效果好，就不需要顾及Tag的问题。单就Co-IP或IP而言，goat抗体最好，mouse次 ...

多谢层主。还有个问题，就是，怎么确定需不需要过表达目的蛋白再做IP，还是说不需要tag时都可以直接用內源蛋白做IP？马上做试验了，着急啊，多谢。
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6楼2014-07-18 14:52:25
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-18 08:46:49
抗体能用就不需要标签...

多谢层主。还有个问题，就是，怎么确定需不需要过表达目的蛋白再做IP，还是说不需要tag时都可以直接用內源蛋白做IP？马上做试验了，着急啊，多谢。
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7楼2014-07-18 14:54:10
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 镜子的诱惑 at 2014-07-18 14:54:10
多谢层主。还有个问题，就是，怎么确定需不需要过表达目的蛋白再做IP，还是说不需要tag时都可以直接用內源蛋白做IP？马上做试验了，着急啊，多谢。...

都可以
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8楼2014-07-18 15:37:13
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

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6楼: Originally posted by 镜子的诱惑 at 2014-07-18 01:52:25
多谢层主。还有个问题，就是，怎么确定需不需要过表达目的蛋白再做IP，还是说不需要tag时都可以直接用內源蛋白做IP？马上做试验了，着急啊，多谢。...

这个没有标准答案，只有做了才知道。理论上都是可行的，实际上也都是可做的，但有时候因为有些内源性蛋白质表达水平很低，做起来比较困难。而transfection则可以根据意愿是蛋白浓度尽可能高些，这样做起来容易。
还有，不知道你做IP的目的是什么，如果是研究蛋白间的相互作用，也可以考虑其他手段，如GST-pulldown assay等。
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9楼2014-07-18 19:45:16
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-18 19:45:16
这个没有标准答案，只有做了才知道。理论上都是可行的，实际上也都是可做的，但有时候因为有些内源性蛋白质表达水平很低，做起来比较困难。而transfection则可以根据意愿是蛋白浓度尽可能高些，这样做起来容易。
...

多谢！做IP的目的是为了发现相互作用的新蛋白，风险很大，看来要转染细胞过表达了，结果更可靠些。
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10楼2014-07-18 20:23:00
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