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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)

[求助] 免疫共沉淀实验抗体的选择 已有2人参与

小弟是新手,刚开始做实验,向诸位请教一个问题。我要做一个蛋白的 IP,520个AA,58/55kDa,查文献都是用标签FLAG的抗体做的,但现在没有这个标签的真核表达载体,想直接转染后用目的蛋白的抗体做,不知道可不可以?还有就是,什么时候用标签,什么时候可以不用?标签的选择有没有要求?请大家不吝指教,**!ps:小弟新虫,金币不多,大家见谅啊!
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
既然用目的蛋白的抗体做IP,还要用标签干什么?
2楼2014-07-17 17:01:27
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-17 17:01:27
既然用目的蛋白的抗体做IP,还要用标签干什么?

看的文献上都是用含标签的目的蛋白基因的载体转染细胞,然后做IP,我想,是不是目的蛋白的抗体不适合做IP,所以转染时需要加个标签,以便用标签蛋白抗体将目的蛋白沉淀下来?如果能直接用目的蛋白的抗体,那正是我所期望的,试验简单啊,,,
3楼2014-07-17 19:28:14
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
做Co-IP时是否选用Tag的抗体不是主要的,重要的是你用的抗体是否可以做IP以及IP的效果如何。所以说,如果你目标蛋白的抗体可以用于IP,且效果好,就不需要顾及Tag的问题。单就Co-IP或IP而言,goat抗体最好,mouse次之,rabbit不是太好,这里好坏的重要标准之一是Western blot时重轻链信号的干扰问题.........
4楼2014-07-17 22:21:05
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 镜子的诱惑 at 2014-07-17 19:28:14
看的文献上都是用含标签的目的蛋白基因的载体转染细胞,然后做IP,我想,是不是目的蛋白的抗体不适合做IP,所以转染时需要加个标签,以便用标签蛋白抗体将目的蛋白沉淀下来?如果能直接用目的蛋白的抗体,那正是我 ...

抗体能用就不需要标签
5楼2014-07-18 08:46:49
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-17 22:21:05
做Co-IP时是否选用Tag的抗体不是主要的,重要的是你用的抗体是否可以做IP以及IP的效果如何。所以说,如果你目标蛋白的抗体可以用于IP,且效果好,就不需要顾及Tag的问题。单就Co-IP或IP而言,goat抗体最好,mouse次 ...

多谢层主。还有个问题,就是,怎么确定需不需要过表达目的蛋白再做IP,还是说不需要tag时都可以直接用內源蛋白做IP?马上做试验了,着急啊,多谢。
6楼2014-07-18 14:52:25
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-18 08:46:49
抗体能用就不需要标签...

多谢层主。还有个问题,就是,怎么确定需不需要过表达目的蛋白再做IP,还是说不需要tag时都可以直接用內源蛋白做IP?马上做试验了,着急啊,多谢。
7楼2014-07-18 14:54:10
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 镜子的诱惑 at 2014-07-18 14:54:10
多谢层主。还有个问题,就是,怎么确定需不需要过表达目的蛋白再做IP,还是说不需要tag时都可以直接用內源蛋白做IP?马上做试验了,着急啊,多谢。...

都可以
8楼2014-07-18 15:37:13
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader


【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 镜子的诱惑 at 2014-07-18 01:52:25
多谢层主。还有个问题,就是,怎么确定需不需要过表达目的蛋白再做IP,还是说不需要tag时都可以直接用內源蛋白做IP?马上做试验了,着急啊,多谢。...

这个没有标准答案,只有做了才知道。理论上都是可行的,实际上也都是可做的,但有时候因为有些内源性蛋白质表达水平很低,做起来比较困难。而transfection则可以根据意愿是蛋白浓度尽可能高些,这样做起来容易。
还有,不知道你做IP的目的是什么,如果是研究蛋白间的相互作用,也可以考虑其他手段,如GST-pulldown assay等。
9楼2014-07-18 19:45:16
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-18 19:45:16
这个没有标准答案,只有做了才知道。理论上都是可行的,实际上也都是可做的,但有时候因为有些内源性蛋白质表达水平很低,做起来比较困难。而transfection则可以根据意愿是蛋白浓度尽可能高些,这样做起来容易。
...

多谢!做IP的目的是为了发现相互作用的新蛋白,风险很大,看来要转染细胞过表达了,结果更可靠些。
10楼2014-07-18 20:23:00
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