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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 分类/鉴定 » pcr-dgge分析土壤微生物多样性
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木木夕星

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr-dgge分析土壤微生物多样性 已有4人参与

pcr-dgge分析土壤微生物多样性，巢式扩增16srdna V3区，一直有非特异性扩增，且目的条带亮度很弱，现在想对第一次pcr产物进行纯化，然后再扩增V3区，这样会影响dgge结果吗？请各位高手指点，给出宝贵意见，谢谢啦
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1楼 2014-06-26 10:26:44
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ltfe567

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助！ 2014-07-01 23:01:00
木木夕星: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢您的指点 2014-07-09 11:00:50
我认为还是优化下PCR 条件，条带弱的话DGGE结果会很不好的，可以先做梯度PCR，摸索退火温度，在做个降落PCR排除非特异条带，
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2楼2014-06-26 10:40:10
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助！ 2014-07-01 23:01:14
木木夕星: 金币+1, ★有帮助, 谢谢，我试试看 2014-07-09 11:01:44
巢式pcr可以做到不出现非特异性扩增的，建议你在优化下条件，比如对第一次pcr产物摸索下稀释梯度，第二次扩增v3区时试试降落pcr.
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3楼2014-06-27 09:52:20
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wubingqi

木虫 (小有名气)
不建议纯化第一次pcr产物，引物纯化比如导致损失。如果你有多个样品，那么不同样品损失的量不同，最后结果肯定反应在条带亮度上，无法比较差异了
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木木夕星
4楼2014-06-27 09:54:17
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lihuanzky

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

技术已经严重OUT了，现在都用高通量测序了
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5楼2014-07-01 20:55:53
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木木夕星

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by wubingqi at 2014-06-27 09:54:17
不建议纯化第一次pcr产物，引物纯化比如导致损失。如果你有多个样品，那么不同样品损失的量不同，最后结果肯定反应在条带亮度上，无法比较差异了

谢谢楼主，我们现在二次扩增时总是出现非特异性扩增，尝试过提高退火温度，降低引物，酶，以及模板的量，但效果不尽人意，还有非特异性扩增带，并且有时有拖尾现象，且较严重，您有什么好的建议吗？期待您的回复
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6楼2014-07-09 11:06:19
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 木木夕星 at 2014-07-09 11:06:19
谢谢楼主，我们现在二次扩增时总是出现非特异性扩增，尝试过提高退火温度，降低引物，酶，以及模板的量，但效果不尽人意，还有非特异性扩增带，并且有时有拖尾现象，且较严重，您有什么好的建议吗？期待您的回复...

巢式PCR，首次扩增全部16s rDNA，然后扩增产物稀释100-10000贝，用作模版扩增V3区。
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7楼2014-07-09 14:19:22
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lance-tan

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

一般V3区采用的巢式PCR扩增，第一轮扩增16S全长应该还是比较好扩增的，建议调节下PCR程序，将第一轮产物扩增好后进行第二轮扩增，再进行第二轮扩增时建议稀释下。条件还是需要自己去摸索的。
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新手入门求各位大神指导
8楼2014-07-17 15:12:15
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hang0604

金虫 (小有名气)
楼主你是测得土壤中的总DNA吗？用什么方法提取的总DNA啊？是试剂盒吗？
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9楼2014-12-09 18:32:19
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