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木木夕星

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr-dgge分析土壤微生物多样性已有4人参与

pcr-dgge分析土壤微生物多样性，巢式扩增16srdna V3区，一直有非特异性扩增，且目的条带亮度很弱，现在想对第一次pcr产物进行纯化，然后再扩增V3区，这样会影响dgge结果吗？请各位高手指点，给出宝贵意见，谢谢啦
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1楼2014-06-26 10:26:44
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助！ 2014-07-01 23:01:14
木木夕星: 金币+1, ★有帮助, 谢谢，我试试看 2014-07-09 11:01:44
巢式pcr可以做到不出现非特异性扩增的，建议你在优化下条件，比如对第一次pcr产物摸索下稀释梯度，第二次扩增v3区时试试降落pcr.
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3楼2014-06-27 09:52:20
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wubingqi

木虫 (小有名气)
不建议纯化第一次pcr产物，引物纯化比如导致损失。如果你有多个样品，那么不同样品损失的量不同，最后结果肯定反应在条带亮度上，无法比较差异了
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木木夕星
4楼2014-06-27 09:54:17
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 木木夕星 at 2014-07-09 11:06:19
谢谢楼主，我们现在二次扩增时总是出现非特异性扩增，尝试过提高退火温度，降低引物，酶，以及模板的量，但效果不尽人意，还有非特异性扩增带，并且有时有拖尾现象，且较严重，您有什么好的建议吗？期待您的回复...

巢式PCR，首次扩增全部16s rDNA，然后扩增产物稀释100-10000贝，用作模版扩增V3区。
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7楼2014-07-09 14:19:22
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