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06nancy

铁虫 (小有名气)

[交流] westen blot怎么转都转不上，求助

目标蛋白分子量时14kd和25kd，bio-rad湿转，0.22um的pvdf膜，总蛋白浓度是0.2mg/mL，上样量做过10ul，20ul。湿转条件是200mA，时间分别做过1h，1.5h和2h，但是marker每次都能很好的转到膜上，但是样品用丽春红染色后发现膜上没有蛋白条带。
ps:我在考虑是不是蛋白浓度太低了，水解了？看了一些资料，资料上说一般一个泳道的上样量在30ug-100ug的蛋白量。求大家帮忙看看我这个实验！谢谢
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1楼 2014-05-29 17:11:00
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grase

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06nancy: 金币+1 2014-05-30 08:34:33
小分子量，丽春红可能不好染色。建议做wb检测。染色看也看不准。看不见并不一定转不上。看见的也未必就是你的目的蛋白。上抗体，直接说嘛问题。
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2楼2014-05-29 18:16:46
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毛线线爱科研

新虫 (初入文坛)
★
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分子量在100kDa以下建议用半干转，你湿转的这个条件有可能把你的目标蛋白转过了吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-05-29 20:53:02
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06nancy

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by grase at 2014-05-29 18:16:46
小分子量，丽春红可能不好染色。建议做wb检测。染色看也看不准。看不见并不一定转不上。看见的也未必就是你的目的蛋白。上抗体，直接说嘛问题。

一抗比较少，不能浪费，所以一直不敢往下做，想确定转膜成功再上一抗
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4楼2014-05-30 08:35:45
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06nancy

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 毛线线爱科研 at 2014-05-29 20:53:02
分子量在100kDa以下建议用半干转，你湿转的这个条件有可能把你的目标蛋白转过了吧

半干转的仪器还没买回来，目前只能湿转
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5楼2014-05-30 08:36:16
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
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06nancy: 金币+5 2014-06-02 16:20:15
你的蛋白含量太低了！先不用考虑别的，把蛋白上样量提上去，我们一般至少上40ug蛋白，蛋白浓度4 mg/mL左右。另外，检测目的蛋白之前，先做内参，确定你的整个体系都没有问题，节约目的蛋白的抗体。
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6楼2014-05-31 18:44:03
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06nancy

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-05-31 18:44:03
你的蛋白含量太低了！先不用考虑别的，把蛋白上样量提上去，我们一般至少上40ug蛋白，蛋白浓度4 mg/mL左右。另外，检测目的蛋白之前，先做内参，确定你的整个体系都没有问题，节约目的蛋白的抗体。

我刚开始接触westen blot，看到关于基因表达的蛋白和组织提取的蛋白都需要内参，我做的蛋白是直接从花粉中提取的水提的蛋白，这个还需要内参吗，若是需要内参，目标蛋白是14kg和25kd，内参如何选择呢？
谢谢
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7楼2014-06-02 16:19:51
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by 06nancy at 2014-06-02 16:19:51
我刚开始接触westen blot，看到关于基因表达的蛋白和组织提取的蛋白都需要内参，我做的蛋白是直接从花粉中提取的水提的蛋白，这个还需要内参吗，若是需要内参，目标蛋白是14kg和25kd，内参如何选择呢？
谢谢...

内参是肯定要的，不过我做的是动物实验，对植物内参的选择不是很了解。你查一下做植物花粉蛋白WB相关的文献，看看别人都用的什么内参。
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8楼2014-06-02 17:55:05
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