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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

[求助] PCR小片段出不来 已有2人参与

最近新订两对了引物，做PCR，四百多的条带出来了，一百多的条带怎么也出不来，试过梯度的，也没出来，模版和四百多的是一样的，只不过P的片段不一样，理论上很好P的呀，所以纠结了，求指点，谢谢。
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1楼 2014-05-10 18:28:41
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
泡菜肉丝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-10 22:11:39
可以尝试调节一下退火温度和延伸时间，另外配胶时可以增加琼脂糖浓度试一下。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2014-05-10 21:21:03
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 天使托 at 2014-05-10 21:21:03
可以尝试调节一下退火温度和延伸时间，另外配胶时可以增加琼脂糖浓度试一下。

嗯，温度调整过了，没用，其他试试吧，谢谢
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3楼2014-05-10 21:22:49
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mehongyu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-01 16:55:36
确定引物序列的准确性了吗？照常理来说100多的不可能出不来，或者是不是胶浓度太低，片段和引物二聚体没有分开。
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4楼2014-05-13 16:06:07
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mehongyu at 2014-05-13 16:06:07
确定引物序列的准确性了吗？照常理来说100多的不可能出不来，或者是不是胶浓度太低，片段和引物二聚体没有分开。

嗯，序列没有问题，可是在100bp以下有淡淡的条带，应该是引物二聚体，1%的胶，胶浓度有很大影响吗？一点点都看不到。下次试下2%的看看吧。谢谢
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5楼2014-05-13 16:46:45
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mehongyu at 2014-05-13 16:06:07
确定引物序列的准确性了吗？照常理来说100多的不可能出不来，或者是不是胶浓度太低，片段和引物二聚体没有分开。

你好 ，我又做了一遍，2%的胶检测的，只有二聚体没有目的片段，温度梯度试过了，请问还能怎么改变下条件？
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6楼2014-05-14 17:07:07
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-05-14 17:07:07
你好 ，我又做了一遍，2%的胶检测的，只有二聚体没有目的片段，温度梯度试过了，请问还能怎么改变下条件？...

目的片段的GC含量怎样？用GC buffer扩过了吗？

实在没办法，只能尝试巢式PCR了。
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7楼2014-05-14 18:16:08
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Lau_Kimura at 2014-05-14 18:16:08
目的片段的GC含量怎样？用GC buffer扩过了吗？

实在没办法，只能尝试巢式PCR了。...

GC含量是43%，没用过这个buffer，试一下吧，谢谢呵呵
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8楼2014-05-14 22:04:38
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