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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 分类/鉴定 » 关于16sr dna 细菌鉴定
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zotingting

金虫 (初入文坛)

[求助] 关于16sr dna 细菌鉴定 已有1人参与

是一步一步按照步骤来做的，可是试了八九次，无论是用PMD-18.19 或者T载体，用的trans 5α或者是别的，没有用蓝白斑筛选，但是最后用m13F和M13r进行鉴定pcr,可是一直都跑不出目标条带（1700Bp左右），求助啊，到底哪里可能出现问题。
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1楼 2014-05-06 09:53:44
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dllchina

木虫 (著名写手)

有机的微生物大神

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助！ 2014-05-06 11:23:49
zotingting: 金币+10, ★有帮助 2014-05-07 18:29:58
1.片段浓度太低，没连上，扩好16S至少回收100微升
2.体系里有些东西过期了？
3.换东西不一定好，别人能做出来，你做不出来，那就是自己操作的问题
4.换个人做
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2楼2014-05-06 10:27:59
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zotingting

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dllchina at 2014-05-06 10:27:59
1.片段浓度太低，没连上，扩好16S至少回收100微升
2.体系里有些东西过期了？
3.换东西不一定好，别人能做出来，你做不出来，那就是自己操作的问题
4.换个人做

第三和第四，第三是同时实验室还有别人在弄，那个人也跑不出来。
第四，已经试过让师兄和实验室另一个老师做，可是也一样没有
第二，链接转化的试剂是新买的，切胶回收的试剂盒也是
第一，切胶回收之后跑的条带还是挺亮的。

求助啊
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3楼2014-05-07 10:43:47
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dllchina

木虫 (著名写手)

有机的微生物大神
引用回帖:
3楼: Originally posted by zotingting at 2014-05-07 10:43:47
第三和第四，第三是同时实验室还有别人在弄，那个人也跑不出来。
第四，已经试过让师兄和实验室另一个老师做，可是也一样没有
第二，链接转化的试剂是新买的，切胶回收的试剂盒也是
第一，切胶回收之后跑的条带 ...

1.你的问题：跑不出目的条带？1700BP左右？16S全长才1500多点。
2.切胶回收后上样1微升很亮么？
3.增大连接体系体积，原来10μ，提到20μ，PMD19载体有可以用氨苄筛蓝白的，你就用呗，
建议把你的样品质量从头到尾给师兄或者老师过一遍，有时候你认为没问题的，师兄他们只是帮你做一下转化么，也许你模板质量不过关~
要么就是载体太挫了，自连了
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4楼2014-05-07 12:19:35
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zotingting

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dllchina at 2014-05-07 12:19:35
1.你的问题：跑不出目的条带？1700BP左右？16S全长才1500多点。
2.切胶回收后上样1微升很亮么？
3.增大连接体系体积，原来10μ，提到20μ，PMD19载体有可以用氨苄筛蓝白的，你就用呗，
建议把你的样品质量从头到 ...

1.第一次对扩增的DNA 跑出的条带大概是在1700bp这样的位置额。
2，切胶回收之后，结合6x loadingbuffer 进行跑胶，老师和师兄都看过，说挺亮的。
3. 没试过增大连接体系体积，不过倒可以试试，只是那个蓝白斑筛选我们实验室不做，直接最后用m13f和m13r引物进行扩增进行鉴定pcr。
好的，我试试全程让老师过一次吧，灰常感谢啦~
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5楼2014-05-07 18:29:45
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xiangchou812

木虫 (小有名气)
IPTG和X-Gal又不贵，为什么就不做呢？不做无形中会增加很多工作量，费时费力费钱！看你写了这么多，其实问题就是没连到克隆载体上。建议改一下目的片段与克隆载体的连接比例，2:1或3:1试一下，另外关键一点看你用的什么酶，高保真酶有3'到5'外切酶活性，会产生平头末端，需要加A后再进行TA克隆。祝你好运！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2014-05-10 07:50:09
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