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wxyabc27

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[求助] 求教关于DNA形成发夹型结构及二聚体结构问题已有3人参与

本人电分析化学小硕一名，实在很low，又由于所在实验室只有我孤军奋战这个方向，无从询问啊。在此，想问大伙关于DNA探针一个问题，是审稿意见，如下：
How to make sure the probes (H1-H4) added to the detection system all maintain a hairpin-like conformation. Is there no self-dimer present in? Please give a solid evident to clarify this concern.
我要怎么证明是发夹型结构啊，实验时是按照文献，先加热至95度在缓慢将至室温进行实验的。

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mininightingale

1楼 2014-05-04 11:31:31

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biostar2009

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【答案】应助回帖

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silicare: 金币+15, MolEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2014-05-12 08:16:46

你这个被提的问题很好，解决起来可能有点麻烦。
比如说你的probe是5‘-AAAAAAAAAANNNNNNNTTTTTTTTTT-3’
可能你要的是退火之后形成hairpin
5‘-AAAAAAAAAANNN
N
3-TTTTTTTTTTNNN
但是，事与愿违，可能会形成：
5’-AAAAAAAAAANNNNNNNTTTTTTTTTT-3‘
3’-TTTTTTTTTTNNNNNNNAAAAAAAAAA-5‘
现在的问题是，一个从高温变性到降温退火程序，并不能区分这两个过程，所以人家问的问题很到位。

我中间写得N有点误导，这几个N可能不太能配对。

现在可能需要你自己仔细分析你的probe序列。

在这两个结构中寻找区别。

楼上有人说走agarose，或者native-PAGE，都有可能是办法，但是都不是solid evidence！！
比如你走了胶，发现你的probe有一条带或者两条带，那你怎么能说这个带，或者两条带中的主带就是hairpin？因为含有loop结构的DNA在native状态下电泳行为是异常的，有时候是由loop的快，比如质粒，有时候又是有loop的慢，这一点在splicing intermediate中间体现得最经典。这还取决于你probe的长度，你需要的不仅仅是DNA size marker。

这个要怎么办？？？

我现在唯一能想到的办法，就是在Tm值上找差异。把你的体系一模一样来一个，你退火好之后。
之后，加点SYBR Green，然后塞到realtime PCR仪里面，只做溶解曲线，你需要把溶解曲线的精度设置小一点，你这两个结构的Tm值肯定差距很大，可以用一些软件计算一下，从溶解曲线上体现的Tm值，你可以肯定说是哪种结构。这个很简单。