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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 求教关于DNA形成发夹型结构及二聚体结构问题
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wxyabc27

铜虫 (小有名气)

[求助] 求教关于DNA形成发夹型结构及二聚体结构问题 已有3人参与

本人电分析化学小硕一名，实在很low，又由于所在实验室只有我孤军奋战这个方向，无从询问啊。在此，想问大伙关于DNA探针一个问题，是审稿意见，如下：
    How to make sure the probes (H1-H4) added to the detection system all maintain a hairpin-like conformation. Is there no self-dimer present in? Please give a solid evident to clarify this concern.
        我要怎么证明是发夹型结构啊，实验时是按照文献，先加热至95度在缓慢将至室温进行实验的。
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mininightingale
1楼 2014-05-04 11:31:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+15, MolEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2014-05-12 08:16:46
你这个被提的问题很好，解决起来可能有点麻烦。
比如说你的probe是5‘-AAAAAAAAAANNNNNNNTTTTTTTTTT-3’
可能你要的是退火之后形成hairpin
5‘-AAAAAAAAAANNN
                             N
3-TTTTTTTTTTNNN
但是，事与愿违，可能会形成：
5’-AAAAAAAAAANNNNNNNTTTTTTTTTT-3‘
3’-TTTTTTTTTTNNNNNNNAAAAAAAAAA-5‘
现在的问题是，一个从高温变性到降温退火程序，并不能区分这两个过程，所以人家问的问题很到位。

我中间写得N有点误导，这几个N可能不太能配对。

现在可能需要你自己仔细分析你的probe序列。

在这两个结构中寻找区别。

楼上有人说走agarose，或者native-PAGE，都有可能是办法，但是都不是solid evidence！！
比如你走了胶，发现你的probe有一条带或者两条带，那你怎么能说这个带，或者两条带中的主带就是hairpin？因为含有loop结构的DNA在native状态下电泳行为是异常的，有时候是由loop的快，比如质粒，有时候又是有loop的慢，这一点在splicing intermediate中间体现得最经典。这还取决于你probe的长度，你需要的不仅仅是DNA size marker。

这个要怎么办？？？

我现在唯一能想到的办法，就是在Tm值上找差异。把你的体系一模一样来一个，你退火好之后。
之后，加点SYBR Green，然后塞到realtime PCR仪里面，只做溶解曲线，你需要把溶解曲线的精度设置小一点，你这两个结构的Tm值肯定差距很大，可以用一些软件计算一下，从溶解曲线上体现的Tm值，你可以肯定说是哪种结构。这个很简单。
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9楼2014-05-07 12:54:02
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yetaieva

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-05-04 14:28:25
跑电泳胶，用DNA Maker 定性
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3楼2014-05-04 12:07:59
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wxyabc27

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yetaieva at 2014-05-04 12:07:59
跑电泳胶，用DNA Maker 定性

用DNA Maker定性是什么意思？能帮我说说跑电泳胶的原理吗，要得到什么结果能说明
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mininightingale
4楼2014-05-04 15:17:39
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yetaieva

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-05 10:04:42
引用回帖:
4楼: Originally posted by wxyabc27 at 2014-05-04 15:17:39
用DNA Maker定性是什么意思？能帮我说说跑电泳胶的原理吗，要得到什么结果能说明...

假设你茎环结构茎部分有10bp，那么你三个茎环结果如果不存在相互杂交应该跑出来的电泳是对应10bp的条带，但是如果相互杂交应该是超过10个bp或者更长，那么跑胶会发现相互杂交后的条带对应更长的DNA Marker
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5楼2014-05-04 15:34:36
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wxyabc27

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yetaieva at 2014-05-04 15:34:36
假设你茎环结构茎部分有10bp，那么你三个茎环结果如果不存在相互杂交应该跑出来的电泳是对应10bp的条带，但是如果相互杂交应该是超过10个bp或者更长，那么跑胶会发现相互杂交后的条带对应更长的DNA Marker...

好像懂了一点。再问问琼脂糖类凝胶电泳和聚丙烯酰胺类凝胶电泳有什么异同，有什么应用范围不同吗？
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mininightingale
6楼2014-05-04 21:33:06
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普通回帖

919663212
，

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-05-04 11:31:58
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meng_xu

铜虫 (小有名气)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-05 10:04:47
page最初应用在测序，对于小片段的DNA分辨力更好
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7楼2014-05-05 00:30:27
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jx917

银虫 (初入文坛)
请问一下，你做发夹结构是参照的哪篇文献呢？
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8楼2014-05-06 22:06:05
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

另外，实话是说，你这个退火程序在dimer和hairpin之间区分度不大，根据你probe的长度，说不定dimer会更稳定。这很有可能会有相当的probe是dimer状态。
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10楼2014-05-07 13:04:53
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