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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR一直p不出来，求大神指点（for DGGE）
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xhy315

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR一直p不出来，求大神指点（for DGGE） 已有2人参与

用的是带GC夹子的16s -V3区引物跑的，细菌是357f-517r，古菌是348f-806r，其中最低的Tm=59.42℃。体系是25ul：buffer 5ul， dNTP 4ul，MgCl2  3.5ul，引物one 1ul，引物two 1ul，模板DNA 1ul，taq酶 0.25ul。 95℃ 10min；30个循环：93℃  1min，50℃ 1min，72℃ 1min10s；72℃ 5min。
这样的反应一直p不出来，求大神指点；
大家帮忙看看，谢谢大家了！
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1楼 2014-04-10 22:33:41
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ccdeweidao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

退火温度太低了，估计非特异性条带会比较多，一般在Tm-5°开始试；另外P不出来的话可以先用不带GC夹的引物P试试，P出来的话再用带GC夹的引物P。
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2楼2014-04-22 17:11:03
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yinlizhangli

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

循环次数 、延伸的时间都跟目的片段的长度有关   可能我们做的不一样  反应体系有些不一样
赞一下 回复此楼
3楼2014-04-22 19:50:04
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