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xhy315

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR一直p不出来,求大神指点(for DGGE) 已有2人参与

用的是带GC夹子的16s -V3区引物跑的,细菌是357f-517r,古菌是348f-806r,其中最低的Tm=59.42℃。体系是25ul:buffer 5ul, dNTP 4ul,MgCl2  3.5ul,引物one 1ul,引物two 1ul,模板DNA 1ul,taq酶 0.25ul。 95℃ 10min;30个循环:93℃  1min,50℃ 1min,72℃ 1min10s;72℃ 5min。
这样的反应一直p不出来,求大神指点;
大家帮忙看看,谢谢大家了!
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ccdeweidao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

退火温度太低了,估计非特异性条带会比较多,一般在Tm-5°开始试;另外P不出来的话可以先用不带GC夹的引物P试试,P出来的话再用带GC夹的引物P。
2楼2014-04-22 17:11:03
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yinlizhangli

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

循环次数 、延伸的时间都跟目的片段的长度有关   可能我们做的不一样  反应体系有些不一样
3楼2014-04-22 19:50:04
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